基于納米顆粒的血漿蛋白質組學中血液成分污染的系統性評估
4月29日，西湖大學醫學院郭天南團隊及合作者在 bioRxiv 發表了預印本文章。研究圍繞當前基于納米顆粒富集血漿低豐度蛋白質組學研究中普遍存在但長期被忽視的一個關鍵問題——血液成分污染（尤其是血小板、紅細胞與凝血相關的蛋白）對血漿蛋白組檢測深度和準確性的干擾，進行了系統性分析并建立系統評估污染策略。
無獨有偶，近日，德國馬普所的蛋白組學大神Matthias Mann，和他的知名高足Phillipp Geyer在bioarxiv上發表一篇題為“Pre-Analytical Drivers of Bias in Bead-Enriched Plasma Proteomics”的研究結果，劍指在質譜血漿蛋白組學領域一直存在的蛋白鑒定數據質量良莠不齊、缺乏標準，甚至人為數據造假的亂象。參考我站評述文章http://www.posuichina.com/html/1086233051.html，與本篇解讀遙相呼應。
研究團隊通過系統優化納米顆粒富集血漿蛋白質的條件，建立了一個高靈敏度的流程OmniProt，構建了覆蓋超過1萬個血漿蛋白的質譜圖庫，并開發了自動化污染識別軟件Baize，全面提升了血漿蛋白質組學的鑒定深度和實驗穩定性與臨床可用性。
圖1 文章截圖
本研究系統評估了血小板、紅細胞和凝血相關污染對基于納米顆粒（nanoparticle, NP）的血漿蛋白質組學實驗的影響，并初步探討了凝血因素的干擾，發現血小板和紅細胞污染是導致血漿樣本蛋白鑒定數量升高和定量結果變異的重要因素之一。研究團隊開發了基于二氧化硅納米顆粒的高通量血漿蛋白質組流程 OmniProt，建立了覆蓋10,109個蛋白組的高質量譜圖庫，并通過污染模型分別篩選出三類污染的特異性蛋白標志物，最終構建了開放獲取的軟件工具Baize用于污染評估。該方法在199例肺結節臨床隊列中得到驗證，表現出高通量、高靈敏度和良好的數據準確性，為血漿蛋白質組在疾病生物標志物研究和臨床轉化中的可靠性與實用性提供了有力支持。盡管納米顆粒富集技術近年來被廣泛應用于提升質譜在血漿中的蛋白鑒定深度，但不同研究之間蛋白鑒定數量差異顯著（2000至7000個不等），引發對其穩定性與可靠性的質疑。尤其是血小板、紅細胞或凝血成分的污染，作為臨床采樣中常見卻易被忽視的問題，可能是造成結果波動的重要原因。為此，本研究通過開發高效的NP富集流程OmniProt、建立大規模血漿譜庫，并引入Baize軟件系統性評估污染影響，全面揭示了污染在血漿蛋白質組分析中的干擾機制，并驗證了該策略在肺癌臨床樣本中的可行性與診斷潛力。
圖2 研究流程
01. 納米顆粒的篩選與性能評估
研究首先針對低豐度血漿蛋白的富集需求，系統比較了不同類型的二氧化硅納米顆粒，包括固體球形、介孔、空心介孔及分級孔結構等類型。
在肺癌患者血漿樣本的重復分析中，所有納米顆粒之間鑒定的蛋白質重疊度超過80%，且實驗重復性良好（CV為1–2%），表明該納米顆粒富集策略技術穩定性高。結果顯示，固體二氧化硅納米顆粒在蛋白質（protein groups）與肽段（peptides）的鑒定數量上均優于其他類型，分別提高了約16%和33%。
進一步比較不同直徑的固體顆粒（300–1000 nm）后發現，盡管蛋白鑒定數目差異不大，但從表面積、離心洗滌效率及操作便捷性等因素綜合考慮，500 nm直徑顆粒（NP23）在性能與實用性之間達成了良好平衡，因此被選為后續工作的最佳納米顆粒材料。
圖3 不同類型的二氧化硅納米顆粒
02. OmniProt血漿蛋白質組流程的建立
在確立NP23為富集載體后，研究優化了關鍵步驟，包括血漿稀釋、蛋白冠形成、洗脫軟冠以及納米顆粒的儲存條件。在稀釋條件對比中，堿性緩沖液（pH 11）顯著提高了蛋白與肽段的鑒定數量（分別提升12%與36%），并在掃描電鏡觀察中顯示出穩定的納米顆粒結構與蛋白冠形成。在優化顆粒用量和孵育時間的實驗中，發現使用0.5 mg納米顆粒、30分鐘孵育為最佳條件。三輪洗滌及7000 g離心條件被證明是有效去除軟蛋白冠的方式。此外，短期在4–30°C范圍內儲存不影響其蛋白富集性能，表明該系統具備較好的溫度穩定性。這些系統性的優化奠定了OmniProt流程的標準化基礎，確保了其在血漿蛋白質組學中的穩定性與重復性。
03. 構建10,000+蛋白質組的血漿譜圖庫
為支持后續數據非依賴性采集（DIA）分析，研究團隊利用21種化學特性不同的納米顆粒對20位肺癌患者的血漿樣本進行蛋白質富集，并通過高pH反相色譜將肽段分為30或60個組分，進而進行Astral nDIA分析，總計生成780個DIA數據文件。
通過DIA-NN分析，最終建立了包含126,661個肽段離子、對應10,109個蛋白組的高覆蓋度譜庫。該數據庫覆蓋了人類血漿蛋白質圖譜中94%的已知蛋白，并顯示出對多種NP特性（如電荷、官能團、親水/疏水性）的響應差異。廈門普睿邁格提供各種不同特性的磁珠（http://www.posuichina.com/Product/MSpretreatment/），可用于評估其在血液樣本中的蛋白冠形成情況。
功能富集分析表明，這些蛋白涉及信號轉導、凋亡、蛋白磷酸化、細胞粘附及先天免疫等多個生物過程，同時揭示了該資源對神經退行性疾病、代謝通路及腫瘤通路的顯著覆蓋能力，體現其廣泛的應用潛力。
利用21種化學特性不同的納米顆粒對20位肺癌患者的血漿樣本進行蛋白質富集
04. OmniProt對低豐度蛋白的檢測性能評估
研究將OmniProt與商用Top14高豐度蛋白去除試劑盒及傳統直接酶解（Neat）方法進行比較。結果表明，OmniProt在蛋白組與肽段鑒定數量上分別比Top14高1.7倍和2.6倍，比Neat方法高4.8倍和5.7倍，顯著提升了低豐度蛋白的檢測能力。尤其在log10強度為3.2–4.5的區間內，OmniProt能檢測更多低豐度蛋白。此外，在人-牛混合樣本的交叉物種定量精度測試中，OmniProt在檢測蛋白數量與定量準確性方面均優于直接分析組，且生物學重復之間的變異系數中位數低于20%，證實了該流程的高靈敏度與高重復性，適用于復雜背景中的精準蛋白定量分析。
圖5 OmniProt的定性和定量評估
05. 不同血漿樣本中蛋白鑒定數量的變異性
在對OmniProt流程優化中發現，在不同的血漿樣本應用中觀察到顯著的蛋白鑒定數量差異，范圍從約3000至7000個蛋白組不等。
進一步分析表明，蛋白鑒定數目較高的樣本中存在大量血小板或紅細胞來源的蛋白，提示樣本可能受到這些細胞成分的污染。這一發現引發了研究團隊對血液污染對蛋白質組分析干擾機制的深入探討，并為后續污染標志物的鑒定與評估工具的開發提供了研究動因。
06. 血小板污染及其標志物發現
為了系統評估血小板污染對NP富集流程的影響，研究構建了PRP（富血小板血漿）與PPP（貧血小板血漿）的混合梯度樣本，并使用Neat和OmniProt流程進行處理。
結果表明，血小板污染顯著增加蛋白鑒定數量，同時干擾低豐度循環蛋白的定量準確性?，F有文獻的30個血小板污染標志物在OmniProt處理下表現相關性降低，提示需建立適用于基于納米顆粒流程的新標志物集。通過Mfuzz聚類與相關性分析，篩選出30個與血小板污染程度高度相關的新標志物（Spearman r > 0.92），涵蓋血小板功能相關蛋白，并通過12例患者樣本驗證。
研究還開發了Baize軟件，通過這些標志物實現污染程度評估（R2 = 0.95）。此外，在不同納米材料處理下，該標志物集表現穩定，具備跨平臺適用性，但污染指數的評估不可在跨納米材料直接比較。
圖6 用于評估血小板污染的生物標志物的發現、驗證及應用
07. 紅細胞污染及其標志物發現
為研究紅細胞污染對NP蛋白質組的影響，研究人員設計了紅細胞-PPP混合梯度模型。紅細胞污染同樣導致蛋白識別數量增加，并干擾紅細胞無關蛋白的定量。研究從高相關性（r>0.98）蛋白中篩選出30個與紅細胞污染相關的新標志物，涵蓋血紅蛋白、細胞膜骨架及氣體轉運蛋白，具有明確生物學特異性。通過六例患者的稀釋梯度實驗進一步驗證，并開發紅細胞污染指數，集成入Baize軟件，實現準確定量（R2=0.94）。
08. 凝血相關的污染及其標志物的發現
研究指出，血漿樣本在采集過程中如操作不當，易因凝血不全而形成血漿-血清混合狀態，影響蛋白質組學的定量結果。
為評估抗凝劑的影響，研究人員比較了使用三種不同抗凝管（EDTA、檸檬酸鈉、肝素）采集的樣本，經Neat與OmniProt處理后的質譜結果。蛋白識別總量無明顯差異，但僅59.2%的蛋白在三種抗凝劑中同時被檢測到，說明不同類型的采血管對蛋白譜具有影響。功能分析顯示，OmniProt在B細胞發育、翻譯起始、免疫及病毒復制相關蛋白上有更強富集。
隨后研究比較了血漿樣本（紫頭管）與血清樣本（紅頭管），經OmniProt處理后，血漿和血清中蛋白識別數量均顯著高于Neat方法（3041 vs 816；3066 vs 796）。通過篩選上下調顯著（fold change ≥ 5，p < 0.05）的蛋白，確定了20個與凝血相關的污染標志物（如FGA、FGG、FGB、AGGF1、TFRC），并將其整合為凝血污染評估模型，引入Baize軟件。
09. Baize軟件：NP血漿污染評估工具
研究人員開發了名為 Baize的網頁工具，用于快速評估NP富集血漿樣本中的三類關鍵污染：血小板、紅細胞和凝血相關污染。
軟件通過計算每類污染標志物信號強度與總蛋白信號之比，生成污染指數（Contamination Index）。用戶上傳蛋白表達矩陣后，Baize可自動輸出各樣本的污染狀態。該工具免費開放，地址為：https://www.guomics.com/Baize
10. OmniProt和Baize在肺癌臨床隊列中的應用
為驗證OmniProt和Baize的實際應用價值，研究分析了199例肺結節患者（含良性、早期惡性及6例晚期對照）的血漿樣本。樣本采用OmniProt流程處理后進行Astral 質譜儀的nDIA方法采集數據，平均每例鑒定出約4413個蛋白組，實驗重復性高。通過Baize檢測出5例存在明顯污染，已從后續分析中剔除。
隨后，研究人員采用8種機器學習算法對良惡性結節進行分類，發現Extra Trees模型在F1分數、準確率、召回率及AUC方面表現最優。
模型最終篩選出與肺癌相關的關鍵蛋白如FSCN1、PDGF、FCGR3A、HAMP、COL15A1等，表明該蛋白組數據具備區分肺癌病理狀態的潛力，盡管進一步驗證仍需獨立隊列支持。
圖7 OmniProt在肺癌臨床隊列中的應用
研究首次系統闡明了血液污染對基于納米顆粒富集血漿蛋白質組學實驗的廣泛影響，提供了技術流程（OmniProt）、計算工具（Baize）與數據資源（譜庫）三位一體的解決方案，為血漿蛋白質組的高通量精準測定及其在臨床疾病生物標志物研究中的應用奠定了堅實基礎。
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