用于組氨酸標簽蛋白純化的Ni親和磁珠
1. 組氨酸標簽蛋白
蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能與多種金屬離子（Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等）發生特殊的相互作用，這些作用包括配位結合、靜電吸附、共價鍵結合，其中以配位結合為主，而且這其中又以His-Tag標簽成為蛋白純化的首選標簽：
a) N末端的His-Tag與細菌的轉錄翻譯機制兼容，有利于蛋白表達；
b) 采用固定化金屬離子親和層析純化His-tag融合蛋白操作簡便；
c) His-Tag對目的蛋白本身特性幾乎沒有影響，而不像GST標簽那樣容易形成而具體，從而影響蛋白特性；
d) His-Tag非常小，不會改變目的蛋白自身的可溶性，相反一些大的標簽如MBP，可大大提高融合蛋白的可溶性，盡管目的蛋白本身是不可溶或者折疊不正確；
e) His-Tag非常小，在融合蛋白結晶后對蛋白結構沒有影響；
f) N末端的His-Tag可通過蛋白內切酶去除；
g) His-Tag既可用于活性蛋白表達的純化標簽，也可用于包涵體表達的純化標簽。
在重組蛋白末端融合多個組氨酸成串的肽段（如圖1-1），憑借其與二價金屬離子的螯合作用（如圖1-2），從而利用親和作用純化蛋白。標簽長度及暴露程度常影響標簽與金屬離子的相互作用，常用的His標簽是6個重復的組氨酸，但在實際操作過程中，根據實際情況可控制組氨酸數目從4-10個不等。較短的標簽與金屬離子的結合更弱，較長的標簽與金屬離子的結合更強；而金屬離子只能和蛋白表面的 His 結合，所以 His 標簽暴露程度越高，結合能力越強。金屬螯合親合層析（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC，如圖1-3），為His-Tag純化標簽的重組蛋白質的分離純化提供了一個有力的工具。
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圖1-1. His-Tag綠色熒光蛋白 |
圖1-2. His-Tag與Ni2+的螯合作用 |
圖1-3. 金屬螯合親合層析柱 |
His-Tag標簽也存在一些缺點，主要有：
a) His-Tag有可能被降解脫落；
b) 在金屬離子存在下可能形成二聚體或四聚體；
c) 在其它蛋白含相鄰組氨酸殘基的情況下，洗脫時可能會帶入雜蛋白。
1. His-Tag蛋白磁分離純化流程
傳統的His-Tag蛋白多利用金屬螯合親合層析柱進行層析分離。磁性納米粒子作為一種新型的介質，利用其在磁場下可快速分離的特點，通過在磁珠表面螯合Ni2+離子，進而將其用于His-Tag蛋白的純化，具有速度快、容易放大、可自動化操作等諸多優點。His-Tag蛋白通過磁性介質進行分離純化的一般流程是裂解、吸附、洗滌、洗脫四個步驟，如圖1-4所示，在流程中經常在洗脫步驟之前增加若干洗滌步驟以除去吸附較弱的非His-Tag蛋白，以期獲得純度更高的目標蛋白。
pH是影響蛋白結合和洗脫的重要因素，一般來說，結合發生在中性偏堿的環境（6.5 - 8.0），洗脫多在偏酸性的環境（< 6.0）。His標簽蛋白在中性或弱堿性pH值（pH7到8）環境下顯現出比在酸性條件下與金屬離子更強的結合能力。在磷酸緩沖液中His標簽蛋白表現出比在Tris-HCl緩沖液中與金屬離子更強的結合能力。咪唑由于可以和His標簽蛋白競爭與金屬離子的結合，所以緩沖液中咪唑濃度的升高，會導致His標簽蛋白與金屬離子結合能力的減弱。一些可以鰲合Ni離子的試劑如EDTA或檸檬酸等等蛋白與金屬離子的結合能力有較大影響，應避免使用。蛋白分離過程主要涉及細胞裂解結合液、洗滌液和洗脫液。
a) 細胞裂解結合液Lysis buffer（Buffer pH，Salt concentration，Stabilizer）
pH：>pI還是<pI；
NaCl：100-300 mM；
Glycerol：5-15 %,…CPI, mild detergent, β-ME
b) 洗滌液Washing Buffer
Lysis buffer + imidazole (1-40 mM) varies from protein to protein
c) 洗脫液Elution Buffer
Lysis buffer + 100-300 mM imidazole
圖1-4. 磁性介質分離純化His-Tag蛋白的一般流程
緩沖液配置基本原則：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或高pH上樣，低pH洗脫，如圖1-5。
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a) pH對組氨酸電離的影響 |
b) 咪唑與組氨酸的競爭結合 |
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圖1-5. 組氨酸標簽蛋白洗脫原理
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固定化金屬親和磁珠（immobilized metal affinity magnetic bead, IMAMB）可以用于可溶性蛋白和包涵體蛋白的純化，兩種方法所需緩沖液不同，具體配置方法表1-1和表1-2。
表1-1. 可溶性組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方
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名稱 |
體積 |
配方 |
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結合緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06 g Tris) |
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清洗緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06 g Tris) |
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洗脫緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06 g Tris) |
表1-2. 包涵體組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方
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名稱 |
體積 |
配方 |
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結合緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06g Tris) |
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清洗緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06g Tris) |
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洗脫緩沖液 |
1L |
50 mM Tris
(6.06g Tris) |
上述緩沖液體系適用于多數組氨酸標簽蛋白的純化，在結合緩沖液中添加一定濃度的咪唑可以降低非特異性結合，提高目的蛋白的純度。初次使用的客戶，可以采用推薦的緩沖液，再根據實驗結果進行調整緩沖液配方及緩沖液中的咪唑濃度。
固定化金屬離子介質是非常穩定的，但在有螯合劑的情況下其金屬離子就會脫落，所以在純化His-Tag融合蛋白時，通常螯合劑EDTA和EGTA必須從溶液中去除。Audur Magnusdottir等人認為，在E. coli的裂解液普遍存在一些非特異的弱螯合劑，如在三羧酸循環中產生了二羧酸類物質；E. coli在面臨某些壓力情況下，會產生高特異性的金屬螯合劑——Metallophores，這是由于這些螯合劑的存在導致His-Tag融合蛋白純化的純度和產量大大降低。這些螯合劑一般存在于細菌的細胞周質中，可通過一個簡單的步驟除去這些螯合劑，使得His-TagTM蛋白的純度和產量得到提高。固定化金屬離子介質通常需要考慮在表1-3所列試劑中的穩定性。
表1-3. 固定化金屬離子介質穩定性考察因素
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Reagents |
Stability |
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Reductants 還原劑 |
5 mM DTE 0.5-1mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione |
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Denaturants 變性劑 |
8 M urea 6 M Gua-HCl |
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Detergent 表面活性劑 |
2% Triton? X-100 (nonionic) 2% Tween? 20 (nonionic) 2% NP-40 (nonionic) 2% cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic) |
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Other additives 其它添加劑 |
500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate |
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Buffer 緩沖液 |
50 mM sodium phosphate, pH 7.4 100 mM Tris-HCl, pH 7.4 100 mM Tris-acetate, pH 7.4 100 mM HEPES, pH 7.4 100 mM MOPS, pH 7.4 100 mM sodium acetate, pH 4 |
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