老鳥們的DNA/RNA 抽提（提取）技巧分享
分子生物實驗核酸的抽提作為整個生物領域最基礎的一個實驗，已漸漸被大家所淡忘。市場上的樣本處理及抽提方法的越來越多，大家越來越把自己的研究重心，放在下游更為重要的實驗。而對于樣本的處理和抽提，更多的人選擇試劑盒，而很少會考慮到樣品本身，或者抽提過程一些遇到的問題。這篇備忘錄旨在針對剛開始接觸核酸抽提實驗的同學做一些簡要的介紹，對已常年浸潤于分子實驗的老鳥們做一些善意的提醒。希望大家在看過這篇備忘錄之后，對于不同的樣品抽提能有更多的感悟。我這里拋磚引玉，也希望大家不吝賜教。
樣品的前處理
分子實驗中需要抽提的主要樣本大致分為這幾類: 血液、細胞、組織、體液、微生物。核酸的抽提，不同的樣本之間存在不一樣的特性，在選擇抽提方式的時候，也要盡量辨別。例如：
1. 細胞中植物細胞相較于動物細胞更難裂解，選擇裂解液和裂解方式的時候需要格外注意。一般的研磨缽可能對于組織及一般的細胞比較好用，但是植物細胞往往需要使用液氮加機械裂解的方法。
2. 對于革蘭氏陽性菌和真菌還需要加入溶菌酶和蛋白酶來輔助裂解，不然提出來的量真是慘不忍睹。
3. 食品的樣本往往需要特殊的提取試劑盒，不然在深加工的過程中，高溫高油脂帶來的PCR抑制效果非常明顯，市面上Purimag 系列、ThermoFisher的PrepSEQ系列、QIAGEN的Mericon系列等。
這里想到自己之前遇到過的情況，在裂解神經組織的時候，大部分人可能覺得和一般的組織的抽提并無區別，但是恰恰相反，神經組織作為有髓鞘包裹的組織，在大腦中脂質含量又比較高，所以屬于比較難提取的一類組織。個人推薦液使用液氮加機械研磨的方法來預處理樣本，并在后續的提取過程中選取相關公司提取脂質的試劑盒來提取。
說到機械破碎儀，市面上很多公司都有破碎儀銷售，方法大致是通過高頻率的震蕩來使細胞破碎，釋放里面的核酸，例如QIAGEN的Tissuelyser系列。這里需要注意的是，超聲破碎儀盡量避免使用，高頻率的聲波會將DNA片段化，影響后續的實驗。
抽提方法
目前市面主要的抽提試劑盒，大致分為三類：磁珠法、沉淀法、柱法。每種方法各有各的優缺點。
磁珠法提取的片段長度較長，且完整，適用于下游二代測序，基因文庫構建等應用。但是，其提取效率與磁珠和核酸的親和性直接相關，這導致了有時候穩定性不會很好，并且各個廠家的磁珠捕獲能力也不盡相同，其中國產的purimag磁珠（www.posuichina.com）和天根磁珠(www.tiangen.com)都是其中的佼佼者。
沉淀法以Life的Trizol法為代表，個人感覺應該是目前是使用比較廣泛的一種方法。其利用試劑將DNA層，RNA層分開，直觀，方便。后期使用異丙醇將DNA，RNA析出并純化的方法，可以滿足絕大多數的分子生物實驗。但是缺點往往也由于加入了不少的有機試劑，DNA/RNA分層有時候不易區分，導致了提取出來的核酸純度不夠，造成濃度虛高的假象。很多實驗室會自己設計核酸提取步驟，大多數也是基于這個原理，先加入高鹽裂解液，然后分離核酸，純化。
另外，個人推薦大家關注一家目前市面較為新的一家公司賽佩（Cepheid），前兩天剛剛40億美元被Danaher收購了，他們家的Xpert? 系列，smartcycler等樣品處理器，設計與目前市場的其他類產品都不大一樣，屬于分子診斷界的一股清流。
抽提溫度
一般核酸的抽提操作溫度都是常溫（15-25攝氏度），這點可能大多數人不會特別注意到。一般在常溫離心的時候，離心機轉速過快導致離心機內溫度升高，以至于機內溫度高于了室溫的情況也是有的。特別是在提取RNA的時候，過高的操作溫度導致RNA降解，還是時有發生。例如在Trizol抽提的時候，有些人會在加入異丙醇讓DNA/RNA析出的時候，為了防止溫度過高，設置離心機溫度為10攝氏度，來抵消離心機溫度上升的影響。
離心機轉速
離心機轉速看似不是很重要，但是往往很多人會忽略。之前又遇到過RPM和RCF (g) 傻傻分不清的同學，所以給大家簡單的復習一下RCF = 1.12×10－5×(rpm)2 r。一般低速離心使用RPM表示而高速使用g。大家抽提的時候可以注意一下轉速的要求，往往提高轉速或者在轉速達不到要求的情況下延長離心時間，會對提取有一定的幫助。
DNA/RNA污染
其實DNA/RNA污染在抽提的過程中很普遍，例如Trizol抽提時，分層不是很明顯，錯將一部分DNA吸入RNA的層，也是時有發生。使用柱提法的試劑盒，膜的親和性并不能完全保證對于DNA/RNA的專一性等情況，都會造成抽提時候的污染。
其實根據個人下游實驗的需求不同，對于DNA/RNA的污染要求也不同。目前市面上的抽提試劑盒，基本不可能保證完全保證抽提的完全純度，少量的DNA/RNA殘留是可以被允許的，不影響大部分的實驗。之前遇到過有人拿某品牌RNA的抽提試劑盒，來抽提病毒DNA，抽出的拷貝數RT-PCR檢測后能達到10^5個。所以大家在選擇購買試劑盒的時候，可以咨詢一下技術人員，是否能將DNA或者RNA去除干凈。如果下游對于DNA/RNA純度要求較高，如建庫，測序等，需要在抽提過程或者抽提結束后加入相應的DNA酶或者RNA酶消化，純化。
核酸質量
目前最流行的方法是nanodrop測量核酸的OD值。通過測量整個溶液的260/280，260/230來確認提取的質量。其中， 280nm是蛋白質的吸收峰, 260nm是NA的吸收峰230nm是有機物的吸收峰，一般是乙醇。所以260/280就是反應提取的蛋白質污染的水平。260/230反應的就是有機污染的水平。一般來說260/280的比值在1.7-2.0之間260/230的比值在1.8-2.1之間，個人經驗來說比值上下浮動0.2可以被允許。 過高的260/230也是存在的，之前自己有碰到過提取出260/230大于10的情況，但是后續實驗沒有影響。個人猜測是酒精去除的較為干凈，導致260相對于230很高。如果DNA降解，260/280變高，所以小伙伴們遇到260/280過高的情況就要警惕了。另外一個較為流行的方法是使用Thermo的Qubit或者QIAGEN 的QIAxpert。他們可以分別測量提取的溶液中單鏈成份和雙鏈成份的比值，測出來更精確，也更直觀。
另外，凝膠電泳分析也往往是必要的。個人建議提取完核酸之后有條件一定要進行凝膠電泳的質量驗證。可以看出DNA/RNA的完整性，相對的濃度，還有片段大小是否符合，可以說一個凝膠電泳，可以讓我對儀器讀出的值，有一個更直觀的感受。在這里我也有幾點需要提醒大家。第一點是希望大家選擇正確的凝膠類型。第二點是希望大家選擇正確的跑膠電壓，時間還有方向。第三點希望大家點樣的時候盡可能的先稀釋核酸，過多的核酸會讓核酸擠在泳道內,使其完全跑不開。
可能大家看到這兩點會不禁笑出聲來，這么基礎的東西為什么也需要列舉出來。但是，由于個人工作的關系，已經不下10次的遇到電壓剛才我提及的三個問題了。在這里個人再做一個提醒，核酸選用瓊脂糖凝膠電泳，電壓盡量不要超過110V，時間不要超過45分鐘就可以了，我們需要看到的僅僅是分開清晰的條帶，并不需要把各個條帶跑多開。個人經驗來說DNA 90v跑15到30分鐘就可以有比較漂亮的條帶出來了。RNA為了防止降解，可以選擇使用140v，5分鐘來跑。如果不是很確定自己的條件是否合適，可以觀察自己的Marker，如果連marker都在膠板上消失了，可以考慮一下我上面提到的條件。
在儀器方面，比較經典的儀器是安捷倫的2100可以通過DIN值，還有RIN值來測量DNA和RNA的完整性。測序公司可能會需要兩個值大于6才能通過質控，但是經驗來說一般的分子實驗大于5就可以了。其他儀器還有QIAGEN的QIAxpert系列目前做的也比較好。
核酸抽提儀
另外，除了上面提到的手動抽提試劑盒，更多的公司選擇研發自動化的工作平臺。這些平臺抽提效率高，抽提重復性好，節省時間，在目前的市場上很暢銷。例如對于一些少量樣本的處理儀比較有名的如ABI，QIAGEN的QIAcube 24，Promega的 maxwell 16， 天根的Tguide 16。對于高通量的樣本有Rocher的 magNA pure 96， QIAGEN的 QIAcube HT, ABI的magmax express 96。另外QIAGEN還有大型工作站QIAsymphony SP/AS 可以將樣品制備和PCR體系的構建結合，目前國內唯一。另外,還有一些國產抽提儀，就不一一列舉了。這些提取儀特別是基于磁珠法的提取儀均能與purimag的DNA提取磁珠完美配合。
小結
核酸提取是一個說簡單不簡單，說復雜不復雜的小型實驗。但是實驗本身會對我們后續實驗產生深遠的影響。個人曾見過一些核酸提取質量不過關，導致后續PCR擴增不出來，測序公司質控不通過，RT-PCR擴增效率低等問題。就在剛剛，有人向我抱怨說測序公司退回了他的樣品，他的RNA已經降解。而當我問他，“你之前有測過RNA濃度”的時候，他只能張著嘴巴說“我沒有測啊”。一句“沒有測”，會導致你需要去排查的問題，從原來只需要檢查運輸儲存條件和提取的耗材問題，增加到從提取開始的大型troubleshooting，最后問題還不一定能夠完全解決。
廈門普睿邁格生物科技有限公司提供的DNA/RNA核酸提取磁珠產品請參考 http://www.posuichina.com/Product/267584288.html
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