蛋白A|Protein A 詳細介紹
在生物化學和分子生物學領域，Protein A作為一種重要的工具蛋白，在抗體純化、免疫沉淀等實驗中發揮著不可或缺的作用。本文將深入探討Protein A的來源、結構、功能、應用及其與其他相關蛋白（如Protein G和Protein A/G）的區別，旨在為讀者提供一個全面而深入的理解。
關鍵點
- 蛋白A是從金黃色葡萄球菌中提取的一個重要抗體結合蛋白，已在抗體純化中應用超過80年。
- 蛋白A具有較高的IgG結合親和力，主要通過與IgG的Fc區進行非共價相互作用。
- 研究表明，工程化的蛋白A可以在更溫和的條件下進行抗體純化，減少抗體的聚合。
- 由于穩定性提升，工程化的蛋白A如Z域、C域等在不同pH環境下表現優異，適合于高樣品負載的應用。
- 各種非特異性結合和雜質去除的方法已被提出，以提高抗體純化的選擇性和效率。
- 納米顆粒（如磁性納米顆粒）作為新的支持材料已被成功應用于蛋白A的結合和抗體的純化。
- 蛋白A還有潛在的應用于生物傳感器，用于低濃度抗體的快速檢測。
由于抗體對病毒性疾病、癌癥、風濕病和其他神經系統的治療作用，它們的產生和純化呈指數級增長。2019 年，美國食品藥品監督管理局 （FDA） 批準了 PD-1 抗體和抗 EGFR mAb 等 90 種 mAb（單克隆抗體），而超過 50 種 mAb 仍處于臨床試驗階段。此外，在治療中，它可以直接附著以激活固體支持物，并用作檢測抗原的敲擊劑 。
抗體中的哪些功能會導致這些特性？免疫球蛋白，即 Igs，分子量約為 150 kDa，兩條重鏈有 450-650 個氨基酸和兩條輕鏈有 214 個氨基酸，斯托克斯半徑為 4 nm，等電點在 4.0-8.6 范圍內。它們由四條多肽鏈組成。兩條相同的 50 kDa γ重鏈和兩條相同的 25 kDa k 或 λ 輕鏈，可產生約 150 KDa 的蛋白質（IgG1、IgG2、IgG4 為 146 KDa，IgG3 為 170 KDa）。兩條重鏈通過二硫鍵在鉸鏈中連接：IgG1 和 IgG4 的兩個鍵，IgG2 的 4 個鍵和 IgG3 的 11 個鍵。此外，輕鏈的最后一個半胱氨酸殘基和重鏈的第五個半胱氨酸殘基產生二硫鍵帶。基于由 82-96% 蛋白質和 4-18% 碳水化合物組成的糖蛋白，人體中的五類 Ig 是 IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。根據 IgG 的結構差異，將其分為四個亞類;IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 在氨基酸水平上相同 90% 以上，而這些小于 10% 的差異（圖 1）對它們的功能和對各種類型抗原的反應起著重要作用。值得注意的是，幾乎所有已使用或未開發的抗體都使用 IgG1 亞類骨架。
圖 1.A） 四個亞類，B） IgG 及其片段的四肽鏈（重鏈;紅色和綠色，輕鏈;黃色）。
基于 Ig結構，Ig 分為兩條重鏈和兩條輕鏈。重鏈包括 N 末端可變結構域 （VH） 和三個恒定結構域 （CH1、CH2 和 CH3），而輕鏈由 N 末端結構域 （VL） 和一個恒定結構域 （CL） 組成。根據結合位點，Ig 分為兩部分;兩個片段抗原結合位點 （Fab） 區域和一個片段可結晶 （Fc） 區域（圖 1）。Fab 和 Fc 區通過二硫鍵連接在一起，稱為柔性鉸鏈區。Fab 作為高選擇性位點與抗原結合，而 Fc 區與許多不同的蛋白質結合，例如含有新生兒 Fc 受體的細胞表面受體和細菌蛋白，如蛋白 A 和蛋白 G 。
IgG3 具有 11 個二硫鍵，而其他 IgG 亞類（IgG1、IgG2 和 IgG4）中只有 2-4 個二硫鍵。它導致 IgG3 有 13 種不同的多態性，稱為同種異型，而 IgG1、IgG2 和 IgG4 分別為 4、1 和 0 種同種異型。這種差異僅導致 IgG3 與蛋白 G 或蛋白 A/G 相互作用，而不與蛋白 A 相互作用。
到目前為止，一些已發表的綜述研究了用于 Ig 親和純化的不同種類的 Protein A，例如蛋白 A 模擬肽和工程蛋白，并比較了不同類型的市售 Protein A 基質及其性質 .納米抗體較小的替代抗體形式，例如抗原結合片段 （Fab） 或帶有末端六組氨酸標簽的單鏈可變片段 （scFv），很容易通過固定化金屬親和色譜純化，但以前的研究表明 His 標簽對納米抗體生物分布有負面影響。
一、Protein A的來源與結構
Protein A是一種來源于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的表面蛋白，其分子量約為42KDa。作為微生物來源的天然蛋白質，Protein A具有與哺乳動物的免疫球蛋白（尤其是IgG）特異性結合的能力。這一特性使得Protein A在抗體純化、免疫沉淀等生物技術領域具有廣泛的應用價值。普睿邁格提供高質量重組蛋白A（http://www.posuichina.com/Product/6945134937.html）。
圖2. A) 蛋白A基因組成包含信號序列（S）、五個IgG結合域（D、E、A、B和C）、細胞壁附著區域（XM），B) IgG Fc區的三個β轉角（灰色片段，上部蛋白）與蛋白A的B域的兩個α螺旋（紅色片段，下部蛋白）之間的相互作用。IgG 結合結構域：E、D、A、B 和 C（每個結構域 58 個氨基酸殘基）沉降在反平行的三個α螺旋中，所有結構域都顯示出與 IgG 的 Fc 區亞類（IgG1、IgG2 和 IgG4）的單獨相互作用，具有親和常數，KA 為 108 （?1），對 IgG3 的親和力非常弱。
Protein A由以下功能域組成：- 5個同源的IgG結合域（E、D、A、B、C），每個結構域均可結合IgG的Fc區域（Fahnestock et al., 1986）。
- 一個C端的細胞壁錨定結構域。
- 研究表明，其對不同物種和IgG亞類的結合效率存在差異，例如對人和兔IgG的結合能力較強，而對鼠、山羊等IgG的結合較弱（Hober et al., 2007）。
- 重組Protein A的優化
- 為克服天然Protein A與部分IgG亞類結合的局限性并提高穩定性，科研人員開發了重組Protein A（如rProtein A），通過引入點突變增強其耐堿性或改變親和力（Jansson et al., 1998）。這些改進降低了配體脫落風險，并延長了層析介質壽命。
結構上，Protein A由多個IgG結合結構域組成，這些結構域能夠特異性地識別并結合IgG的Fc區段，而與Fab區或輕鏈的結合則相對較弱。此外，天然的Protein A還含有一些未知功能的非Fc結合域，這些區域在Protein A與雜蛋白的結合中可能發揮一定作用，從而影響純化后IgG的純度。
| 蛋白質 | 尺寸 （kDa） | 目標 | 洗脫 pH |
|---|---|---|---|
| 蛋白 A | 42 | FC、Fab | 3.5 |
| 蛋白 G | 30 | Fc、Fab、ScFv | 3.2 |
| 蛋白 L | 76–106 | Fab、ScFv、κ 輕鏈 | 2 |
| 蛋白質 Z | 6.7 | Fc | 3.6 |
| 蛋白質 LG | 50 | Fc、κ 輕鏈 | 2 |
| 蛋白 LA | 60 | Fc、κ 輕鏈 | 2 |
| 蛋白 AG | 47.3 | Fc | 3 |
CIP 是親和層析過程中的必要步驟，用于從純化設備中去除聚集的蛋白質、核酸和脂質等污染物。CIP 通常以一種簡單易行的方式使用濃度為 0.1 M 的氫氧化鈉 （NaOH） 作為最有效的清潔劑>去除緊密結合的變性和聚集物種，并滅活大多數微生物，如細菌、病毒和內毒素 。雖然這種方法很容易使用并以低成本實現，但所有設備、蛋白質和基質都必須在高 pH 值下保持穩定。為了提高蛋白 A 在堿 pH 值的穩定性，蛋白質工程取得了成功的結果，其中最著名的是對源自 B 結構域的 Z 結構域的研究 。
Nilsson 于 1987 年根據蛋白 A 的 B 結構域的第二個結構提出了 Z 結構域的第一個概念。根據這些文章，直接參與 Fc 區和蛋白 A 相互作用的氨基酸位于每個結構域的兩個螺旋上。盡管如此，研究證明，存在于結構域 E、D 和 A 中的蛋氨酸殘基會增加蛋白 A 的敏感性。此外，在 28-29 位存在天冬酰胺-甘氨酸 （Asn-Gly） 對高 pH 值敏感，并且在 CIP 惡劣條件下脫氨基。該反應是自發的、依賴于水的，并因氫氧根離子而加速。因此，缺乏 Asn-Gly 和降低水分含量是可取的。
1. 純化抗體
Protein A在抗體純化中的應用是其最為突出的功能之一。通過將Protein A偶聯于支持物（如瓊脂糖、磁珠等）上，可以構建一個高效的抗體純化系統。當含有抗體的生物樣品（如血清、腹水、細胞培養液等）流經這個系統時，抗體中的Fc區段會與Protein A結合，從而實現抗體的分離和純化。瓊脂糖蛋白A磁珠請參考（http://www.posuichina.com/Product/0293713052.html）
值得注意的是，由于Protein A與IgG的結合具有高度的特異性，因此這種方法能夠高效地去除樣品中的其他雜質，如血清白蛋白、細胞碎片等，從而得到高純度的抗體。此外，通過調整偶聯條件、洗脫條件等參數，還可以進一步優化純化效果，滿足不同實驗需求。
2. 免疫沉淀
除了純化抗體外，Protein A還常用于免疫沉淀實驗中。免疫沉淀是一種利用抗原-抗體特異性結合原理，從復雜蛋白混合物中分離出特定蛋白的方法。在實驗中，首先將特異性抗體與目標蛋白結合形成抗原-抗體復合物，然后利用Protein A與IgG的結合能力，將抗原-抗體復合物吸附到Protein A偶聯的支持物上。最后，通過洗脫等步驟，可以得到純化的目標蛋白。
免疫沉淀技術不僅可以用于研究蛋白質-蛋白質之間的相互作用，還可以用于研究蛋白質的翻譯后修飾、定位等生物學特性。此外，結合質譜等高通量分析技術，免疫沉淀還可以用于蛋白質組學研究，為揭示細胞內的蛋白質網絡提供有力工具。
3. 去除或減少非特異性背景
在免疫沉淀等實驗中，非特異性背景的存在往往會影響實驗結果的準確性和可靠性。為了降低非特異性背景，可以在實驗中加入Protein A/G Beads等試劑。這些試劑能夠吸附樣品中的非特異性蛋白和雜質，從而降低背景干擾。同時，由于Protein A/G具有更廣泛的抗體結合能力，因此還可以用于純化那些不能與Protein A單獨結合的抗體。
三、Protein A與其他相關蛋白的區別
在抗體純化與免疫沉淀領域，除了Protein A外，還有Protein G和Protein A/G等蛋白也常被用于這些實驗中。為了更全面地理解Protein A的作用和優勢，我們需要將其與其他相關蛋白進行比較和分析。
1. Protein G
除了蛋白 A，還有一些關于蛋白 G 的研究，它對 IgG（所有亞型）和人血清白蛋白都有親和力。蛋白 G 的 C 端包含三個均相 IgG 結合結構域，具有一個中央 α 螺旋和三個分子量為 11.5 kDa 的 β 折疊 。Protein G是一種來源于鏈球菌G族的細胞表面蛋白，也是III型Fc受體的一種。與Protein A類似，Protein G也具有與IgG特異性結合的能力。然而，與Protein A不同的是，Protein G不僅能夠結合IgG的Fc區段，還能夠結合Fab區段。這使得Protein G能夠更廣泛地結合多種類型的IgG分子，包括那些不能與Protein A結合的IgG。重組蛋白G購買請參考（http://www.posuichina.com/Product/6093125842.html）
此外，Protein G還具有較低的血清蛋白結合水平，因此純化得到的產物純度較高。同時，由于Protein G的配基脫落率較低，因此在使用過程中能夠保持較高的穩定性和可靠性。然而，需要注意的是，Protein G對某些特定種屬的抗體（如兔抗體）的親和力可能較低，因此在選擇使用時需要根據實驗需求進行權衡。
2. Protein A/G
當然，由于它與白蛋白的非特異性相互作用，已經對結構修飾進行了一些嘗試，例如僅使用 IgG 結合結構域作為配體或它們與蛋白 A 結構域的偶聯。Dong 及其同事成功地設計了蛋白 A 的 D 結構域與蛋白 G 的 C1 結構域的結合，其結合常數值分別比蛋白 G 和蛋白 A 高 12 倍和 8.4 倍。Protein A/G是一種兼具Protein A和Protein G特點的融合蛋白。它結合了Protein A和Protein G的結合位點，因此具有更廣泛的抗體結合能力和更高的特異性。這使得Protein A/G在純化抗體和降低非特異性背景方面表現出更優異的性能。
此外，由于Protein A/G具有更大的特異性表面區域和更多的表面抗體結合位點，因此在使用過程中能夠減少非特異性結合的發生。這使得Protein A/G在免疫沉淀等實驗中具有更高的靈敏度和準確性。然而，需要注意的是，由于Protein A/G結合了兩種蛋白的特點，因此其制備成本可能相對較高。
四、Protein A的應用案例與注意事項
1. 應用案例
在實際應用中，Protein A已被廣泛應用于各種抗體純化、免疫沉淀等實驗中。例如，在制備單克隆抗體時，可以利用Protein A偶聯的磁珠從細胞培養液中快速分離和純化抗體；在研究蛋白質相互作用時，可以利用Protein A進行免疫共沉淀實驗，從而揭示蛋白質之間的相互作用網絡；在疾病診斷和治療中，可以利用Protein A純化的抗體進行免疫組化、流式細胞術等檢測手段，為疾病的診斷和治療提供有力支持。
2. 注意事項
在使用Protein A進行抗體純化或免疫沉淀實驗時，需要注意以下幾點：
- 選擇合適的偶聯條件：不同的偶聯條件會影響Protein A與抗體的結合效率和穩定性。因此，在選擇偶聯條件時需要根據實驗需求進行優化。
- 控制洗脫條件：洗脫條件是影響純化效果的關鍵因素之一。通過調整洗脫液的pH值、離子強度等參數，可以優化洗脫效果，提高抗體的純度和回收率。
- 避免非特異性結合：非特異性結合是影響實驗結果準確性的重要因素之一。為了減少非特異性結合的發生，可以在實驗中加入適量的抑制劑或進行預清除處理。
- 注意實驗安全：由于Protein A來源于金黃色葡萄球菌等微生物，因此在實驗過程中需要注意無菌操作和安全防護，避免實驗污染和交叉感染的發生。
Protein A作為一種重要的工具蛋白，在抗體純化、免疫沉淀等生物技術領域具有廣泛的應用價值。通過深入了解Protein A的來源、結構、功能及其與其他相關蛋白的區別，我們可以更好地利用這一工具蛋白進行科學研究和技術開發。
未來，隨著生物技術的不斷發展和創新，Protein A的應用領域將會更加廣泛和深入。例如，在抗體藥物研發中，可以利用Protein A進行高效、快速的抗體篩選和純化；在蛋白質組學研究中，可以利用Protein A進行高通量的蛋白質分離和鑒定；在疾病診斷和治療中，可以利用Protein A純化的抗體進行更加精準和有效的檢測和治療手段。
總之，Protein A作為一種重要的生物技術工具，將在未來的科學研究和技術創新中發揮更加重要的作用。我們相信，在不久的將來，Protein A將會為生物科學領域的發展帶來更多的驚喜和突破。
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