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一、概述
氨基磁珠（PuriMag G-NH2）是具有-NH2表面官能團(tuán)的超順磁微球，由Fe3O4核和GMA涂層組成。通過GMA的化學(xué)修飾，-NH2基團(tuán)通過短的親水性連接臂連接到氨基磁珠上。親水表面確保氨基磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性和易操作性。具有表面反應(yīng)性胺基的磁珠允許配體如蛋白質(zhì)、肽、碳水化合物或其它特異性分子的固定。配體的固定可以通過醛或酮的還原胺化而不預(yù)先活化氨基磁珠表面。或者，EDC交聯(lián)劑可用于羧基將配體與胺偶聯(lián)。最后，胺反應(yīng)性雙功能交聯(lián)劑可用于引入其他官能團(tuán)以偶聯(lián)配體。
PuriMag G-NH2可以用肽、酶、碳水化合物等包被以分離不同的靶標(biāo)，如激素、受體、凝集素、疾病標(biāo)志物、噬菌體。一旦與配體結(jié)合后，將氨基磁珠加到含目標(biāo)分子的樣品中，短時(shí)間孵育后，可通過磁珠親和捕獲靶標(biāo)。磁分離可除去不需要的上清液，洗滌目標(biāo)結(jié)合的磁珠以得到純樣品。氨基磁珠結(jié)合的靶標(biāo)可直接用于生物測定，并在SDS-PAGE上分析。用常規(guī)洗脫方法可將目標(biāo)分子從磁珠上洗脫下來。
二、產(chǎn)品特性
1. 短臂氨基磁珠 PuriMag GS-NH2
基團(tuán)密度> 600 umoles amine/g beads
2. 長臂氨基磁珠 PuriMag GL- NH2
氨基密度> 300 μmoles amine/g beads
形態(tài)：超順磁球形
直徑：200 nm
儲(chǔ)存：10 mg/mL ，去離子水中 2~8 °C保存，勿凍結(jié)。
常溫運(yùn)輸，正確使用保存期一年。
方案1. 用于連接醛和酮
含有醛和酮的配體可通過形成Schiff's堿與氨基磁珠偶聯(lián)，并用氰基硼氫化鈉還原胺化。醛基可通過高碘酸鈉氧化糖蛋白中的糖殘基或多糖中相鄰羥基的C-C鍵的裂解而容易地制備。
緩沖液
?偶聯(lián)緩沖液 Coupling Buffer (0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl or 100mM sodium borate, pH9.5 or 100mM sodium citrate, pH9.5);
? 5M Sodium Cyanoborohydride in 1M NaOH;
? 0.1M Ethanolamine, pH7.4;
清洗氨基磁珠
1. 徹底重懸氨基磁珠并轉(zhuǎn)移足量磁珠到干凈EP管中。
2. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
3. 從磁力架上取下EP管，加入200μl偶聯(lián)緩沖液并重懸氨基磁珠。
4. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
5. 用上述緩沖液清洗兩次。
配體的結(jié)合
1. 將配體溶解偶聯(lián)緩沖液中至濃度1-10 mg/ml。
2. 將適量的配體加入洗過的氨基磁珠并混勻。
3. 每100μl反應(yīng)混合物中加入1μl的5M氰基硼氫化鈉（溶于1M NaOH溶液），室溫下孵育2小時(shí)。
5. 加入反應(yīng)混合物相同體積的0.1M乙醇胺，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘。
6. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
7. 加入適量的PBS并混勻氨基磁珠。
8. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
9. 重復(fù)步驟7-8兩次。
方案2. 用NHS交聯(lián)劑活化
最常見的一類活化劑是NH。根據(jù)交聯(lián)劑的性質(zhì)，可與待固定的配體中的化學(xué)基團(tuán)反應(yīng)，包括胺、巰基、羧基和羥基以及非選擇性光反應(yīng)。NHS交聯(lián)劑通常必須在使用前新配。與待固定的配體量相比，使用10倍摩爾過量。
?偶聯(lián)緩沖液Coupling Buffer (0.1 M sodium phosphate buffer with 0.15 M NaCl, pH 7.4);
? 0.05 M Tris, pH 7;
3. 從磁力架上取下EP管，加入200μl偶聯(lián)緩沖液并重懸磁珠。
氨基磁珠的活化
1. 用偶聯(lián)緩沖液重懸氨基磁珠。
注意：避免含有氨基的緩沖液如Tris或甘氨酸，因?yàn)樗鼈儠?huì)與NHS反應(yīng)競爭。
2. 根據(jù)制造商的說明溶解NHS，并將所需體積加入磁珠，混勻。可將水溶性NHS直接加入磁珠中。最終體積應(yīng)等于小瓶中最初的液體體積。
3. 在室溫下孵育30分鐘。
4. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。用上面的緩沖液洗兩次。
5. 磁珠活化完成。
方案2-1. 用-NH2反應(yīng)性的NHS-酯交聯(lián)劑活化后偶聯(lián)
使用同雙功能交聯(lián)劑時(shí)，第二個(gè)NHS-酯基團(tuán)將與配體中的-NH2反應(yīng)，因此通常用于固定肽或蛋白質(zhì)的N-末端。步驟如下：
1. 重新懸浮活化的氨基磁珠。使用相同的緩沖液將體積調(diào)整到所需的磁珠濃度。
2. 加入計(jì)算后一定量的配體，混勻。
3. 室溫下孵育30分鐘或4°C下緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)2小時(shí)。
4. 孵育后，將試管置于磁鐵上2分鐘，取出上清液。
5. 加入0.05M 的Tris（pH7）并在室溫下溫育15分鐘以猝滅未反應(yīng)的活性氨基。
6.用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠兩次。
。
方案2-2. 用-SH反應(yīng)性的NHS-酯交聯(lián)劑活化后偶聯(lián)
巰基活性基團(tuán)通常是吡啶二硫基或碘代/溴代乙酰基。寡核苷酸也可使用馬來酰亞胺。適當(dāng)?shù)木彌_液和孵育條件與巰基反應(yīng)，配體須含待固定的游離巰基。
1. 重新懸浮活化的磁珠。根據(jù)所選的巰基反應(yīng)基團(tuán)使用緩沖液（請參見下表）。使用相同的緩沖液將體積調(diào)整到所需的磁珠/配體濃度。
2. 加入計(jì)算量的游離巰基配體，渦旋混勻。
3. 按下表推薦的時(shí)間和溫度孵育。
4. 孵育后，可加入半胱氨酸至終濃度為5mM以淬滅未反應(yīng)基團(tuán)。室溫下孵育15分鐘。
5.如所述洗滌偶聯(lián)的磁珠。
SH-reactive group
Recommended buffer
Recommended condition
Maleimide
0.1M sodium phosphate pH 6.5-7.5
4 h at 4℃ or 2 h at room temperature
Iodo/
Bromoacetyl
0.05M sodium borate pH8.3
1h, room temperature. Protect from light.
Pyridyldithio
Phosphate buffered saline (PBS) pH7.5
Over night at room temperature
方案2-3. 用光反應(yīng)性的NHS-酯交聯(lián)劑活化后偶聯(lián)
光反應(yīng)基團(tuán)如羥苯基疊氮化物、硝基苯疊氮化物、苯疊氮化物或全氟芳基疊氮化物等可與胺基反應(yīng)。帶有光反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑的活化必須在暗室條件下進(jìn)行。
1. 重新懸浮活化的氨基磁珠。根據(jù)活性基團(tuán)選擇緩沖液。用相同緩沖液將體積調(diào)整到所需的磁珠/配體濃度。
3. 使用推薦的時(shí)間、溫度、適當(dāng)波長的光照射。
注意：磁珠可能會(huì)熄滅光，因此須優(yōu)化。
4.將偶聯(lián)的磁洗兩次。
注意：磁珠與DMF等有機(jī)溶劑相容，上述活化和偶聯(lián)均可在干燥有機(jī)溶劑中進(jìn)行。這將消除競爭性水解反應(yīng)，因此通過延長反應(yīng)時(shí)間可獲得更高產(chǎn)率。將磁珠從有機(jī)溶劑移至緩沖液之前，用純水洗滌一次。
方案3. 用EDC活化偶聯(lián)
在配體中不存在其它伯氨基的條件下，通過使用EDC或EDC / NHS（或其他碳化二亞胺）可將磁珠表面的胺基和配體上的羧基偶聯(lián)。 EDC與羧基反應(yīng)形成胺反應(yīng)性中間體。羧基的EDC活化產(chǎn)生非常不穩(wěn)定的中間體，迅速水解，因此配體需快速添加。或者，可使用NHS的兩步法方案來產(chǎn)生較穩(wěn)定的中間體在較長時(shí)間內(nèi)反應(yīng)。這兩種方法的方案如下。
偶聯(lián)緩沖液Coupling Buffer (0.1M MES Buffer, 0.9% NaCl);
注意：對于使用EDC的偶聯(lián)反應(yīng)，避免使用含游離胺或磷酸鹽的緩沖液，因?yàn)檫@會(huì)干擾偶聯(lián)效率。Tris，乙酸鹽和甘氨酸緩沖液都易與EDC或偶聯(lián)中間體反應(yīng)。還應(yīng)避免含硫醇緩沖液，因?yàn)樗鼈儾豢赡娴亟Y(jié)合EDC并抑制偶聯(lián)。
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC);
Sulfo-NHS or N-hydroxysuccinimide (NHS);
封閉緩沖液Quenching Buffer (50mM Tris, pH 8.0 or 5-10mM Hydroxylamine);
PBS;
使用NHS進(jìn)行兩步活化偶聯(lián)
1. 用偶聯(lián)緩沖液配制50 mg/ml的EDC溶液；用偶聯(lián)緩沖液配制50 mg/ml的sulfo-NHS或NHS溶液。
注：EDC溶液和NHS溶液應(yīng)新配，避光保存在冰上。
2. 將60μl的偶聯(lián)緩沖液、20μl的EDC溶液和20μl的NHS溶液加入洗好的磁珠中，混勻。
3. 在室溫下孵育15分鐘。
5. 加入含0.1-3mg/ml抗體或配體的50μl的偶聯(lián)緩沖液并重懸磁珠。
6. 在室溫下傾斜旋轉(zhuǎn)30分鐘或在4°C過夜孵育。
7. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
8. 加入100μl的偶聯(lián)緩沖液并重懸磁珠。
9. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
10. 轉(zhuǎn)到封閉磁珠方案封閉未反應(yīng)基團(tuán)。
使用EDC一步活化偶聯(lián)
1. 用偶聯(lián)緩沖液配制50mg / ml的EDC溶液。
注：EDC溶液應(yīng)新配，避光保存在冰上。
2. 加入含有0.1?3mg/ml抗體或配體的50μl的偶聯(lián)緩沖液并重懸磁珠。
3. 將60μl的偶聯(lián)緩沖液和20μl的EDC溶液加入洗好磁珠中，混勻。
4. 在室溫下孵育30分鐘。
5. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
6. 加入100μl的偶聯(lián)緩沖液并重懸磁珠。
8. 重復(fù)步驟6?7兩次。
9. 轉(zhuǎn)到封閉磁珠方案封閉未反應(yīng)基團(tuán)。
封閉磁珠
1. 加入500μl封閉緩沖液并重懸磁珠。
2. 在室溫下孵育30分鐘。
3. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
4. 加入500μl封閉緩沖液并重懸磁珠。
6. 加入500μL的PBS，pH7.4（或優(yōu)選的緩沖液）并重懸磁珠。將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。重復(fù)洗滌兩次。
7. 加入100μL的PBS，pH7.4（或優(yōu)選的緩沖液）并重懸磁珠，4°C儲(chǔ)存。
附錄1：免疫共沉淀分析
1. 將至少100μl含有靶抗原的細(xì)胞裂解物樣品加入到來自步驟7的磁珠管中并渦旋10秒。
2. 室溫孵育30分鐘或4°C過夜，輕輕搖動(dòng)。
3. 將試管置于磁力架上60秒，棄去上清液，然后從磁力架上取下試管。
4. 加入200μl洗滌緩沖液并重新懸浮磁珠。將試管置于磁力架上60秒，棄去上清液，然后從磁力架上取下EP管。再洗兩次去除未結(jié)合的抗原。
5. 采用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液并在95°C加熱磁珠5分鐘。將磁珠/上樣緩沖液混合物直接加到SDS-PAGE凝膠上，并按正常進(jìn)行電泳和印跡。
抗體和抗原的排除
1. 向磁珠、抗體、抗原混合物中加入20μl洗脫緩沖液并重懸磁珠。
2. 在室溫下孵育2分鐘。
3. 將EP管放在磁力架上60秒。
4. 將上清液收集到干凈的EP管中，然后加入2μl中和緩沖液（例如1M Tris-HCl，pH8.5）調(diào)節(jié)pH。
更多氨基磁珠請參考：
二氧化硅包覆氨基磁珠 http://www.posuichina.com/Product/9816244839.html
瓊脂糖氨基磁珠 http://www.posuichina.com/Product/0925682317.html
部分引用本磁珠文獻(xiàn)
1. Xiaoke Zheng, Liying Zhao, Dongxiao Wen, Xiaolan Wang, Huaixia Yang, Weisheng Feng, Jinming Kong. Ultrasensitive fluorescent detection of HTLV-II DNA based on magnetic nanoparticles and atom transfer radical polymerization signal amplification, Talanta, Volume 207, 15 January 2020, 120290 （氨基磁珠PuriMag G-NH2偶聯(lián)適配體檢測病毒）
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