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一、概述
醛基活化的瓊脂糖磁珠（Magarose-CHO）可以簡單有效地將蛋白質(zhì)共價(jià)固定在磁性珠狀瓊脂糖載體上，為抗體、抗原或其他生物分子的親和純化提供了有價(jià)值的工具。 活化的載體含有醛官能團(tuán)，其與蛋白質(zhì)或其他分子上的伯胺自發(fā)反應(yīng)。 在溫和的還原劑氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）存在下，形成的希夫堿被還原成穩(wěn)定的仲胺鍵。無論配體的分子量或pI如何，通過該還原胺化機(jī)理偶聯(lián)的效率通常大于80％。 一旦配體被固定，制備的瓊脂糖磁珠可以在磁場下快速用于多輪親和純化。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose-CHO
貨號(hào)
PMAG012
磁珠濃度
25% (v/v) in 0.02% sodium azide
配基密度
~ 50 μmol CHO/ ml磁珠
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
>20 mg IgG/ml磁珠
保存
常溫運(yùn)輸，2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白結(jié)合量與目標(biāo)蛋白特性相關(guān)，此處僅作參考值。
三、使用方法
1. 緩沖液
? Coupling Buffer: 0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl, pH 7.2 (PBS)
? Cyanoborohydride Solution (NaCNBH3): 5M NaCNBH3 in 1M NaOH
Note: Prepare this solution in a fume hood because NaCNBH3 is toxic.
? Quenching Buffer: 1M Tris?HCl, pH 7.4
? Wash Solution: 1M sodium chloride (NaCl)
2. 樣品制備（蛋白質(zhì)溶液）
將1-20mg蛋白質(zhì)或1-2mg肽溶解于2-3mL Coupling Buffer。對(duì)于已存在于溶液中的蛋白質(zhì)，用偶聯(lián)緩沖液將樣品稀釋4倍，或脫鹽/透析以偶聯(lián)緩沖液替代蛋白原有緩沖液。
注意：如果蛋白質(zhì)溶液含有伯胺（例如Tris或甘氨酸），則必須徹底除去這些化合物，否則它們將與預(yù)期的蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生競爭。
3. 偶聯(lián)方法
A. 蛋白質(zhì)固定化
1) 將體積2ml（沉降體積）的Magarose-CHO磁珠平衡至室溫并磁分離，用3倍磁珠體積的Coupling Buffer洗滌平衡磁珠3分鐘，磁分離。洗滌三次。
2) 加入2-4mL蛋白質(zhì)溶液（溶于Coupling Buffer中）至磁珠中。保存0.1mL制備的樣品，用于隨后測定偶聯(lián)效率。
3) 在通風(fēng)櫥中，向反應(yīng)液中加入40μL氰基硼氫化鈉溶液（得到~50mM NaCNBH3）。
4) 在室溫下震蕩搖動(dòng)6小時(shí)或在4℃下過夜混合反應(yīng)。磁分離，收集上清，通過比較未結(jié)合部分的蛋白質(zhì)濃度與起始樣品來確定偶聯(lián)效率。
5) 用4mL 的Coupling Buffer洗滌磁珠。
B. 封閉剩余活性位點(diǎn)
1) 用4mL 的Quenching Buffer清洗磁珠。
2) 在通風(fēng)櫥中，向磁珠中加入2mL的Quenching Buffer和40μL的Cyanoborohydride Solution（當(dāng)與磁珠混合時(shí)產(chǎn)生~50mM NaCNBH3）。
3) 振蕩反應(yīng)1h，磁分離收集磁珠。
4) 用2倍磁珠體積的Wash Solution洗滌磁珠三次，最終保存在Coupling Buffer中，備用。
4. 蛋白質(zhì)親和純化的一般方案
注意：該方案使用磁珠體積為2mL。對(duì)于其他體積的磁珠，相應(yīng)地調(diào)整所有溶液（例如，樣品、洗滌和洗脫）體積。所需的蛋白質(zhì)樣品的量和孵育時(shí)間取決于所涉及的親和系統(tǒng)（例如，抗體-抗原相互作用），并且必須進(jìn)行優(yōu)化。
A. 所需的材料
? Binding/Wash Buffer: Phosphate Buffered Saline (PBS), Tris Buffered Saline (TBS) or other buffer that is compatible with the intended affinity interaction.
? Sample: Prepare antigen or other molecule in Binding/Wash Buffer, or dilute sample 1:1 in Binding/Wash Buffer
? Elution Buffer: IgG Elution Buffer or 0.1-0.2M glycine?HCl, pH 2.5-3.0
? Neutralization Buffer (optional): 1mL of high-ionic strength alkaline buffer such as 1M phosphate or 1M Tris; pH 9
B. 親和純化程序
1) 將制備的磁珠平衡至室溫，磁分離除去上清液。
2) 將樣品加入磁珠中，振蕩混合30分鐘。磁分離，收集上清液，保存用于測定親和效率。
3) 用12 ml的Binding/Wash Buffer洗滌磁珠除去非特異性吸附的蛋白。磁分離，去除上清液。
4) 加入8mL的Elution Buffer洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，磁分離，收集上清洗脫液。每1mL收集的洗脫液中加入50μL中和緩沖液。
5) 通過280nm處的吸光度監(jiān)測洗脫。將感興趣的組分通過脫鹽或透析交換到合適的儲(chǔ)存緩沖液中。
C. 磁珠再生和儲(chǔ)存
1) 用16mL 的Binding/Wash Buffer洗滌磁珠以除去任何殘留的蛋白質(zhì)并重新激活磁珠。
2) 用8mL含有0.05％疊氮化鈉的Binding/Wash Buffer平衡磁珠。
客戶發(fā)表論文：
1. Jiang S, Lin Y, Zheng S. Development of the IMP biosensor for rapid and stable analysis of IMP concentrations in fermentation broth[J]. Biotechnology Journal, 2024, 19(6): 2400040. （瓊脂糖磁珠偶聯(lián)蛋白）
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