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rev. 19/04/24
Small 1 ml (50 assays)
Large 10 ml (500 assays)
概述： PuriMagTM NTA-Fe磁珠采用固定化金屬親和色譜法捕獲磷酸化肽。帶負電荷的磷酸基團被磁珠上帶正電荷的金屬離子吸引。結合液相色譜串聯質譜 （LC-MS/MS），該方法使研究人員能夠以高度的特異性和靈敏度分離、鑒定和定量大量磷酸化肽，從而全面了解細胞和組織樣品中的磷酸化。等效替代High Select? Fe-NTA Magnetic Phosphopeptide Enrichment Kit。
背景：固定化金屬親和色譜法（IMAC）已被廣泛用于通過與負電荷簇結合來富集生物樣品中的蛋白質和肽。二價過渡金屬離子 Co2+、Cu2+、Ni2+ 和 Zn2+ 常用于純化富含聚組氨酸或半胱氨酸的蛋白質以及具有金屬親和力的蛋白質。三價金屬離子 Fe3+、Ga3+、Al3+ 以及 Ti4+ 和 Zr4+ 通常用于蛋白質組學研究的磷酸肽富集。亞氨基二乙酸 （IDA） 或次氮基三乙酸 （NTA） 用于將金屬離子螯合到瓊脂糖包被的磁珠。在比較研究中，NTA在選擇性捕獲和鑒定更多磷酸肽方面比IDA表現更好。Ga3+ 和 Fe3+ 在鑒定的磷酸化肽數量方面具有可比性。與使用 TiO2 的金屬氧化物親和色譜（MOAC）相比，IMAC- Fe3+ 的性能略好，TiO2 偏愛酸性磷酸化肽 （pI > 4），而 Fe3+偏愛酸性較低的肽 （pI < 4）。PuriMagTM NTA-Fe磁珠為磷酸化肽富集提供了一種有效的工具，對磷酸化殘基環境幾乎沒有偏見。它們可以單獨使用，也可以與基于免疫親和力的富集結合使用，以補充任何 LC-MS/MS 蛋白質組學研究。
注意： 對于長期儲存，建議用乙腈、甲醇和 0.01% 乙酸的等比例混合物 （1：1：1 v/v/v） 替換 NTA-Fe 磁珠儲存緩沖液。制備溶液并使用HPLC級試劑進行洗滌。取出儲存緩沖液，用 1 mL 水洗滌珠子 3 次。取出水洗液，向每個測定管中加入 1 mL 長期儲存緩沖液。在 4°C 下儲存。
儲存：PuriMagTM NTA-Fe磁珠以20%乙醇形式提供。對于長期儲存，用長期儲存緩沖液（1：1：1 v/v/v 甲醇、乙腈和 0.01% 乙酸）代替緩沖液。有關詳細信息，請參閱協議。儲存在4oC 下。不要冷凍珠子。
使用說明：在含尿素的緩沖液中裂解細胞，用蛋白酶消化細胞蛋白，通過反相固相萃取純化所得肽。
然后使用IMAC Beads富集磷酸化肽。通過洗滌除去未結合的肽，并用堿性pH緩沖液洗脫捕獲的磷酸化肽。對濃縮富集的肽進行LC-MS/MS分析之前，在微量尖端上進行反相純化，以脫鹽和分離肽與雜質。詳細的實驗方案如下。
PuriMagTM NTA-Fe磁珠富集流程:
A. 溶液和緩沖液
注意：用HPLC級水制備溶液。三氟乙酸和乙腈應為最高等級（Sequanal）。溶液的所有百分比規格均為體積/體積。
1. 上樣緩沖液: (0.1% TFA, 85% acetonitrile) For 5 mL, combine 4.25 mL ACN, 0.725 mL water, and 25 μL 20% TFA.
2. 洗滌緩沖液: (0.1% TFA, 80% acetonitrile) For 50 mL, combine 40 mL ACN, 9.75 mL water, and 250 μL 20% TFA.
3. 洗脫緩沖液: (50% acetonitrile, 2.5% ammonia) For 5 mL, combine 0.45 mL 28% ammonia with 2.05 mL water then add 2.5 mL ACN.
4. 新配 1 M ammonium bicarbonate (AMBIC) stock solution.
5. 配制 5% TFA: adding 50 μL 20% TFA to 150 μL water
B. 流程 (用于胰蛋白酶進行二次消化)
注意：在IMAC富集之前，需要使用測序級胰蛋白酶進行二次消化，以最大程度地減少遺漏的切割位點。
1. 制備測序級胰蛋白酶消化溶液（5% 乙腈、50 mM 碳酸氫銨和 100 ng/uL 胰蛋白酶）。將 33 μL 水與 2.5 μL 1M 碳酸氫銨、2.5 μL 乙腈和 12 μL （5 μg） 胰蛋白酶混合。
2. 在室溫下，將 0.5 mg 凍干肽在 1.7 mL 微量離心管中以 2,000 × g 離心 5 分鐘，以沉淀管底部的所有材料。用微量移液器移液幾次，機械地將沉淀重懸于50μL胰蛋白酶消化溶液中。
注：溶解肽后，在pH試紙上點少量（1-2μL）檢查肽溶液的pH值，pH值應接近8.0或不低于6.0。在極少數情況下，pH 值呈酸性較強（由于在次優凍干條件下無法充分去除肽中的 TFA），用未調整 pH 值的 1 M AMBIC 溶液滴定肽溶液。1-2 μL 通常足以中和溶液。
1. 在 37°C 下消化兩小時。通過加入 5 μL 5% TFA 終止反應并使溶液酸化。
2. 向消化的肽溶液中加入 0.95 mL 上樣緩沖液（0.1% TFA，85% 乙腈）。
3. 在微量離心機中以10,000×g在4°C下離心5分鐘，使溶液澄清。不溶性顆粒可能看起來相當大。這不會造成問題，因為大多數肽都是可溶的。
4. 重懸 NTA-Fe 磁珠。使用移液器吸取 20 μL 磁珠并轉移到微量離心管中。
5. 用 1 mL 洗滌緩沖液洗滌 PuriMagTM NTA-Fe 磁珠 3 次。磁分離，取出洗滌劑，注意不要去除任何磁珠。
6. 將澄清的肽溶液轉移到裝有PuriMagTM NTA-Fe 磁珠的離心管中，確保立即混合。
7. 在室溫下以最大速度在振蕩器上孵育 30 分鐘。
8. 磁分離，然后取出上清液，注意不要取出任何磁珠。耗盡的肽溶液可以在-80°C下冷凍并保存以備其他實驗使用。
9. 加入 1 mL 洗滌緩沖液洗滌磁珠，移液槍吹打直至珠子完全重懸。磁分離，然后用微量移液器除去上清液。再重復洗滌兩次，除去任何剩余的上清液。
10. 加入 50 μL 洗脫緩沖液（50% 乙腈、2.5% 氨水），洗脫磁珠上的磷酸肽。移液槍吹打直至珠子完全重懸，磁分離。
11. 用 0.5 mL 乙腈沖洗新的微量離心管以去除任何污染物，渦旋并丟棄沖洗液。將含有洗脫的磷酸肽的上清液轉移到沖洗過的試管中。
12. 加入 40 μL 20% TFA 以酸化洗脫液。
13. 重復洗脫步驟，并將所得洗脫液混合。
14. 在 Speed-Vac 中干燥洗脫的磷酸肽（約 3 小時）。用 40 uL 0.1% TFA 復溶干燥的磷酸肽。
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