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SP3（single-pot, solid-phase-enhanced sample-preparation）是一種基于順磁顆粒的蛋白質組預處理工作流程，通過有機溶劑乙醇或乙腈驅動驅動蛋白在羧基或其它親水性磁珠表面被捕獲（如圖所示）。標準 SP3流程中，蛋白質通過親水相互作用機制與磁珠結合，結合了蛋白的磁珠被束縛在溶劑化層，可沖洗去除不需要的污染物，然后在一定條件下洗脫純化的蛋白質。這種親水捕獲機制類似于親水相互作用色譜（HILIC）中所涉及的機制，已被廣泛證明是分離多種生物分子的有效工具。利用該機制，SP3可實現蛋白質和肽的無偏回收、與大量化學物質（如洗滌劑、離液劑和鹽）兼容，可在大范圍的輸入量上定量回收，促進自下而上的深層蛋白質組學分析。SP3磁珠是Purimag Bead專為Protein Clean蛋白組學前處理設計的高效磁珠。其獨特的表面化學性質和穩定的磁性性能，使得SP3磁珠在蛋白分離、純化等過程中表現出色。無論是小規模實驗還是大規模生產，SP3磁珠都能提供高效、穩定的蛋白組學前處理解決方案。
SP3是一種簡單的方案，其中所有步驟都在單管中進行，可快速完成，測試成本低。此外，其適用于機器人自動化，而無需定制硬件。由于這些優勢，SP3已被用于大量蛋白質組學實驗，從對單個人類卵細胞、果蠅胚胎、免疫細胞、腎和臨床腫瘤組織的高靈敏度篩選，到對細胞系、其它模式生物、純化提取物、染色質中的蛋白質-DNA相互作用以及細胞外基質混合物的深入分析，都受益于SP3方案提供的簡單穩健處理。SP3方案可與許多常用的磁珠類型和表面化學相容，如AMPure（Beckman-Colter）和其它羧基或胺基的磁珠（Dynabeads carboxyl、Dynabeads amine、MagReSyn carboxyl、MagReSyn amine和MagReSyn-HILIC）。理論上，任何有親水涂層的功能化磁珠都應與SP3兼容。SP3方案中最常使用的是Cytiva的Sera Mag SpeedBeads（GE Healthcare），提供了測定性能與成本之間最佳平衡。Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified [E7] Magnetic Particles (cat. no. 45152105050250，Hydrophilic)和Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified [E3] Magnetic Particles (cat. no. 65152105050250，Hydrophobic) 兩種類型的SeraMag磁珠的專有涂層在表面親水性方面差異微小。當在SP3中單獨使用時，這兩種磁珠類型提供了大致相同的性能，但可以觀察到基于親水性的肽富集效率的微小差異。使用兩種類型磁珠的組合來消除任何潛在的差異，能更好保持結果的一致。
廈門普睿邁格生物科技有限公司推出類似SeraMag兩種類型的磁珠SP3-H-Carboxyl和SP3-O-Carboxyl，可替代SeraMag磁珠在SP3方案中的應用。
SP3-H-Carboxyl
Cat：SP30045
1ml、15ml
Hydrophilic
SP3-O-Carboxyl
Cat：SP30065
Hydrophobic
l 概述
SP3-Carboxyl羧基磁珠是0.4 μm 磁性顆粒，表面有均勻羧基。具有快速的磁響應、高結合載量、大比表面積、高靈敏度，穩定性好，物理完整性好，反應動力學快。SP3-Carboxyl羧基磁珠磁含量為（~ 70%）。
l 典型應用
蛋白組學樣品預處理SP3過程應用。
l 處理介紹
使用過程中，應控制顆粒的單分散性和均勻懸浮液，以提供穩健且可重復的性能。將 SP3-Carboxyl羧基磁珠儲存在 2~ 8°C 下，如顆粒沉降，則重新懸浮。SP3-Carboxyl羧基磁珠在分子生物學中常用的較寬pH和溫度范圍內保持穩定，例如胍裂解緩沖液和 PCR 熱循環溫度。
l 重懸
顆粒不完全重懸會導致檢測開發問題。超聲重懸顆粒逆轉由偶聯反應誘導的輕度聚集。
l 滅菌
SP3-Carboxyl羧基磁珠不是無菌的。該制劑含疊氮化鈉（0.05%），如防止微生物生長的防腐劑。建議在顆粒長期儲存后評估細菌污染。細菌污染可以通過在適當的生長培養基上接種和在72小時后檢查平板來評估。珠子可以通過用70%乙醇洗滌來滅菌。不要將珠子高壓滅菌，因為這可能導致部分至嚴重的磁珠聚集。蛋白偶聯的微珠不能滅菌。
l 化學相容性
SP3-Carboxyl羧酸鹽修飾磁珠是與尿素（6 至 8 M）和 EDTA 相容。
l 防止聚合
為防止顆粒聚集，請避免以下情況：強酸性 pH 值（羧基和磺酸鹽基團質子化）的緩沖液、強堿性pH值（胺基去質子化）的緩沖液、冰凍溫度、加熱、過度渦流、過度超聲處理（特別是對于蛋白質標記的磁珠）、微生物。
蛋白質制備 ● 定時 2 小時
1 將 ThermoMixer 預熱至 60 °C。
2 在 1.5 mL 試管中以 1 mg/mL 的復溶溶液制備 1 mL BSA 儲備溶液。
關鍵步驟 如果使用需要還原和烷基化但尚未進行還原和烷基化的蛋白質混合物（例如細胞裂解物），請在此處用您的樣品代替 BSA 輸入并按照說明進行操作。
3 將準備好的BSA原液管在60°C的ThermoMixer中加熱30分鐘，以1000 r.p.m混合。
4 從熱混合器中取出試管，使其在實驗室工作臺的架子中冷卻至室溫。
5 向BSA管中加入100μL的 IAA儲備液來烷基化還原二硫化物，然后室溫避光孵育30分鐘。
關鍵步驟 IAA 對光敏感。溶液應新鮮制備，并在黑暗中進行孵育。
6 向BSA管中加50μL的DTT原液淬滅烷基化反應，然后室溫孵育15分鐘。
暫停點 制備的樣品（本例中為BSA）可以無限期地儲存在-80°C下。
SP3 蛋白純化和消化 ● 定時 30 分鐘 + 18 小時孵育
7 將 ThermoMixer 預冷至 24 °C。
8 在復溶溶液中將制備的10 μg（10 μL 制備的1 mg/mL 原液）BSA稀釋至最終體積48 μL。
9 加入100 μg的SP3磁珠并移液混勻。這是2 μL（50μg/μL SP3）磁珠原液，終體積為 50 μL 蛋白質溶液。
關鍵步驟 確保溶液中SP3磁珠完全均質化。輕柔移液吹打混合。混合不當會降低SP3的蛋白質回收效率。
10 為誘導蛋白質與珠子結合，向含SP3珠子的BSA混合物中加入50 μL乙醇。短暫搖晃試管以均質化。
關鍵步驟 避免加入乙醇后過度搖晃混合物，盡量減少磁珠粘附在管上部而造成的損失。通過初始混合步驟完全均質化并非必需；水相和乙醇相部分整合就足夠了。在下一步孵育中，將使用混勻儀完全混合。
11 將結合混合物在24°C的ThermoMixer中以1,000 r.p.m孵育5分鐘。
關鍵步驟 避免以>1000 r.p.m.的速度混合。快速混合會導致聚集的磁珠粘附管壁，可能降低蛋白回收率。
關鍵步驟 觀察孵育后磁珠的聚集。微珠的聚集表明蛋白質在微珠表面結合。聚集量與輸入材料的數量成正比，并取決于結合條件（例如，反應體積和珠子數量）。
12 結合完成后，將試管放入磁力架中并孵育，直到珠子遷移到管壁上。
關鍵步驟 觀察被磁架吸引時管壁上珠子的結合模式。珠子在內管壁周圍分布是結合材料的良好指示。非常細的珠子線可能表明少量或沒有結合的蛋白質。
13 取出未結合的上清液并將其丟棄在適當的廢液容器中。
關鍵步驟 從試管中取出上清液，注意不要破壞磁珠。
關鍵步驟 在故障排除過程中，可以保留上清液并通過另一種測定法（例如，SDS-PAGE）進行分析，以檢查SP3結合步驟的效率。在該上清液中應觀察到很少或沒有蛋白質。
14 從磁架上取下試管，加入180 μL的80%乙醇SP3沖洗液和移液器混合以復溶并沖洗珠子。
關鍵步驟 在移液器混合和沖洗SP3珠子時，沒必要過于激烈。強力混合會導致蛋白質損失。建議使用200 μL吸頭進行標準移液，在用180 μL體積的80%乙醇復溶磁珠后進行3~4次。
15 將試管放在磁架上并孵育，直到珠子遷移到管壁上。
16 取出上清液，注意不要破壞珠子。
關鍵步驟 上清液可以保留并通過另一種測定進行分析（例如，SDS-PAGE）作為故障排除過程的一部分，以確定漂洗步驟中的潛在損失。在該上清液中應觀察到很少或沒有蛋白質。
17 再重復步驟 12-16 兩次，以完全沖洗與 SP3 珠子結合的蛋白質。
關鍵步驟 去除最后的 80% 乙醇沖洗液后，注意從試管中取出盡可能多的殘留沖洗液（<5 μL 是最佳的），以避免殘留到酶消化步驟中。無需將 SP3 磁珠完全風干。
18 從磁架上取下試管，加入 100 μL 含有 0.4 μg 胰蛋白酶 + rLysC 混合物的消化溶液。
關鍵步驟 加入消化液后，不要用移液管混合磁珠。避免粘稠SP3磁珠附著在移液吸頭上，從而導致損失。
關鍵步驟 此處胰蛋白酶用量僅用于示例。常使用1：25（wt/wt）的胰蛋白酶與蛋白比例進行標準消化。該比率應根據樣品類型進行優化。
19 使用200 μL移液器，輕輕地將未被液體覆蓋的珠子沿管壁推入消化溶液中。不要嘗試移液混合物。
關鍵步驟 如SP3磁珠加入消解液后自然復溶成溶液，則輕搖試管將所有磁珠移入液體中。不要輕彈管子。
20 如可用，在水浴中超聲處理30秒以分散。如無超聲水浴，則37°C和1000 r.p.m.混合孵育10分鐘。
關鍵步驟 超聲處理增強了消化前珠子的解聚。在超聲儀中孵育，直到觀察到珠子的分解。
關鍵步驟 這種預孵育可幫助分散磁珠，更易移液。然而，孵育后磁珠可能仍非常粘稠，尤其在蛋白質量很高的情況下。可延長孵育時間，以允許蛋白開始水解（如，1-2 小時），以進一步增強磁珠的重建。
21移液混合以確保珠子正確復溶，并在37°C下ThermoMixer中以1000 r.p.m.混合孵育18小時。
關鍵步驟 此處使用的消化孵育時間僅用于示例。較短的持續時間可成功使用，但應根據樣品類型優化。
22消化完成后，將試管在20,000g下在24°C離心1分鐘。
關鍵步驟 執行離心步驟將有助于肽回收，而不會殘留微球，因為SP3微球會堵塞色譜柱。
23 將試管放在磁架上，直到珠子沉淀在試管壁上，然后將上清液移到新試管中。
關鍵步驟 收集上清時避免去除磁珠而干擾下游分析。重復離心（步驟22），如磁珠殘留，則回收上清。
關鍵步驟 如果樣品含有珠子，請勿繼續冷凍儲存。確保在儲存前完全去除珠子。
暫停點 制備的肽可以無限期地儲存在-80°C下。
24 繼續對肽樣品進行MS分析。
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