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1. 概述
蛋白磷酸化參與多種細胞過程，約30%蛋白可實現磷酸化修飾。很多研究聚焦于蛋白的翻譯后修飾。然而，因磷酸化肽豐度低、化學計量低和理化特性特殊等因素，導致長期以來蛋白質組尺度上的磷酸化研究都是蛋白質組學研究的一個重要挑戰。因此，當前迫切需要能特異富集磷酸化肽、且與質譜分析兼容的富集技術。
二氧化鈦具有富集磷酸絲氨酸（pSer）、磷酸蘇氨酸（pThr）和磷酸酪氨酸（pTyr）殘基的選擇性親和力。TiO2-功能性磁珠（PuriMag Si-TiO2）是一種專有的磁性材料微粒載體，能在復雜生物樣品的蛋白消化物中簡單、方便、高效、高特異、高重復性富集磷酸化肽。磁珠表面的二氧化鈦納米粒子對于單磷酸化肽和多磷酸化肽沒有明顯的偏好，因而非常適合單步富集磷酸化肽用于基于質譜的蛋白質組學分析。PuriMag Si-TiO2以其出色的特異性，超越競爭對手的產品，具有較高的磷酸化肽回收率。PuriMag Si-TiO2技術的優勢如下：
l 對磷酸化肽高特異性；
l 對單磷酸化肽和多磷酸化肽無明顯的偏好；
l 小于10s的快速磁響應性，減少樣品損失，更適合自動化操作；
l 抗氧化特性，降低樣品被污染風險。
2. 產品信息
名稱
PuriMag Si-TiO2
用途
分離富集磷酸化肽
磁核
四氧化三鐵
表面聚合物
二氧化硅
表面功能基團
二氧化鈦（TiO2）
結合容量
>10 μg phosphopeptides /mg bead
尺寸
~400 nm
濃度
25 mg/ml，保存于20% 乙醇
穩定性
pH 2.5–12; 4–60℃
儲存
4–8℃，避免冷凍
3. 結合和洗脫程序
上樣緩沖液（Loading buffer）: 1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN) and 5% trifluoroacetic acid (TFA) ；
洗滌緩沖液（Wash buffer）: 80% ACN, 1% TFA ；
洗脫緩沖液（Elution buffer）: 1% NH4OH；
影響磷酸肽結合的因素包括：緩沖液的組成、pH值以及是否存在污染物/干擾化合物。磁珠使用量應根據應用進行優化，建議使用過量的含磷酸肽樣品使磁珠飽和。
注意：為確保最佳性能，所有的試劑應為分析級新鮮配制。后續的操作流程所使用的緩沖液僅作為示例，并非限制。PuriMag Si-TiO2磁珠在磷酸肽富集過程中與一系列不同的緩沖液兼容。為達到最好的純度和產量，應優化的具體富集過程的實驗條件。
3.1 PuriMag Si-TiO2磁珠的平衡
PuriMag Si-TiO2磁珠以25 mg/ml濃度，保存于20% 乙醇中。使用前應對磁珠進行洗滌和平衡，可根據實際需要放大和縮小磁珠用量。最小體積為10微升的微粒懸浮液是確保磁珠能與緩沖液分離。以下方案是從約500μg的總蛋白質消化液中純化磷酸肽。
1）渦旋混合PuriMag Si-TiO2磁珠以確保均勻分散。
2）轉移40μl（1mg）PuriMag Si-TiO2磁珠到2ml離心管。
3）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
4）用200μl的70％乙醇溫和洗滌微粒（例如間或渦旋混合）5分鐘。
5）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
6）重復步驟4和5。
7）用100μl的1％NH4OH輕輕洗滌微粒（例如間或渦旋混合）10分鐘。
8）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
9）50μl上樣緩沖液平衡磁珠60秒。
10）將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
11）重復第9步和第10步兩次，共三次平衡。
13）除去上樣緩沖液后，PuriMag Si-TiO2磁珠可用于結合目標磷酸肽。
3.2 磷酸肽富集過程
1) 用上樣緩沖液調整消化后蛋白至合適濃度（包含~ 500μg總蛋白）與平衡好的PuriMag Si-TiO2磁珠相匹配。
注意：若磷酸肽為固體，請用不低于100μl的上樣緩沖液溶解。
2) 渦旋或移液器吸打混勻磁珠。
3) 室溫孵育20分鐘，過程中確保樣品和磁珠的混合懸浮。
4) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
5) 100μl的上樣緩沖液溫和洗滌30秒，去除未結合的樣品。
6) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
7) 100 μl洗滌緩沖溫和洗滌2分鐘，去除非特異性結合的多肽。
8) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移棄上清。
9) 重復第7步和第8步2次，共洗滌3次。
10) 使用溶液（10% ACN和0.2% TFA）額外洗滌兩次。
11) 80μl洗脫緩沖液洗脫15分鐘，確保洗脫過程中磁珠的懸浮和混合。
12) 重復第11步，再用80μl洗脫緩沖液洗脫兩次。共獲得240μl洗脫樣品。為獲得濃縮樣品，可用3×40μl洗脫緩沖液用于洗脫過程。
13) 將離心管放在磁分離器上，放置30秒，移取上清到一新離心管。
14) 增在240μl洗脫液中加入60μl 10%甲酸（FA）酸化樣本。
15) 用質譜分析樣品。質譜分析前，可對樣本脫鹽（如C18），濃縮（如真空離心或凍干）。
4. 問題解決方法
問題
可能原因
解決方案
磷酸肽不結合磁珠
結合pH不合適
確保上樣緩沖液pH為2.5-3.0
使用的磁珠太少
增加磁珠使用量
反應時間不夠
增加孵育時間至30分鐘
干擾物質阻礙結合
對樣品進行脫鹽或透析
非特異性結合
洗滌體積不夠
增加洗脫體積
洗滌時間不夠
增加洗脫時間
緩沖液配制有誤
正確配制新鮮的緩沖液
磷酸化多肽回收率低
不正確的洗脫緩沖液濃度
確保洗脫緩沖液NH4OH高于0.5%
樣品濃度過低
冷凍干燥或真空離心濃縮樣品
樣品中污染物導致的離子抑制
對制備的磷酸化多肽脫鹽（如C18柱）
引用該產品文獻：
1. Bin Luo, et al. Metal–Organic Framework-Derived Hollow and Hierarchical Porous Multivariate Metal-Oxide Microspheres for Efficient Phosphoproteomics Analysis, ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 29, 34762–34772, https://doi.org/10.1021/acsami.1c10795 (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
2. Liu, Jun, et al. Direct analysis of metabolites in the liver tissue of zebrafish exposed to fiproles by internal extractive electrospray ionization mass spectrometry, Analyst, 2021, 146(14): 4480-4486，http://dx.doi.org/10.1039/D1AN00490E, （TiO2磁珠）
3. Binbin Wang, et al. Phosphonate-Functionalized Ionic Liquid: A New Surface Modifier Contributing to the Enhanced Enrichment of Phosphorylated Peptides, ACS Sustainable Chem. Eng. 2021, 9, 23, 7930–7940, https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.1c02119 (TiO2磁珠)
4. Bin Luo, et al. Bifunctional magnetic covalent organic framework for simultaneous enrichment of phosphopeptides and glycopeptides, Analytica Chimica Acta, Volume 1177, 2021, 338761, https://doi.org/10.1016/j.aca.2021.338761. (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
5. 鄒倫妃,張啟偉,肖琛等.基于酰胺化的化學標記技術在磷酸化多肽分析中的應用[J].質譜學報,2022,43(04):463-472. （Si-TiO2用于磷酸化多肽富集）
6. 劉軍. 基于內部萃取電噴霧電離質譜的典型含氟污染物誘導魚類代謝紊亂研究[D].吉林大學,2022.DOI:10.27162/d.cnki.gjlin.2022.001228. （Si-TiO2用于代謝物富集）
7. Lihong Gao, et al. Nanocomplexes with anchored Rubpy32+-tetraethylene pentamine electrochemiluminescence system: Self-enhanced coupled photothermal strategy detection of thyroglobulin, Journal of Electroanalytical Chemistry, Volume 947, 2023, 117767, https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2023.117767. (TiO2磁珠修飾)
8. 鄒倫妃.基于化學標記法篩選2,6-二氯苯醌的生物毒性標志物[D].江漢大學,2023.DOI:10.27800/d.cnki.gjhdx.2023.000396. （Si-TiO2用于磷酸化多肽富集）
9. Sen Zhang, et al. Magnetic Ti3C2 MXene Nanosheets Prepared for Enrichment of Phosphopeptides, ACS Appl. Mater. Interfaces 2023, 15, 13, 16505–16514, https://doi.org/10.1021/acsami.3c00848 (TiO2磁珠富集磷酸化多肽)
10. Gongzhen Liu, et al. Proteomics and phosphoproteomics reveal novel proteins involved in Cipangopaludina chinensis carcasses. Front. Chem., 29 August 2024, Sec. Analytical Chemistry, Volume 12 - 2024 | https://doi.org/10.3389/fchem.2024.1416942 (TiO2磁珠和IMAC-Ti磁珠用于磷酸化蛋白質組學分析)
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