熱點前沿：蛋白冠在前沿血漿蛋白質組學研究中的作用
Saei, A. A., Sun, L., & Mahmoudi, M. (2024). The role of protein corona in advancing plasma proteomics. Proteomics, e2400028. https://doi.org/10.1002/pmic.202400028
摘要：蛋白冠是生物環境中圍繞納米顆粒形成的生物分子層，嚴重影響納米顆粒與生物系統的相互作用，影響藥代動力學和生物結果。最初，蛋白冠給納米醫學和納米毒理學帶來了挑戰，例如細胞培養物中的營養消耗和納米顆粒靶向物種的掩蓋。然而，最近的進展凸顯了它在環境毒性、蛋白質組學和免疫學方面的潛力。該觀點側重于利用蛋白冠來提高血漿蛋白質組分析的深度，解決血漿中蛋白質濃度的高動態范圍帶來的挑戰。蛋白冠簡化了樣品制備，富集了低豐度蛋白質，并提高了蛋白質組覆蓋率。創新包括使用不同的納米顆粒和加標小分子來增加定量蛋白質的數量。核心設施的可重復性問題需要標準化的方案。此外，自上而下的蛋白質組學可實現蛋白質形式特異性測量，從而更深入地了解蛋白冠的組成。未來的研究應旨在改進自上而下的蛋白質組學技術，并將蛋白冠研究和蛋白質組學相結合，以實現個性化醫療和高級診斷。
1 引言
蛋白冠是一層生物分子，主要是蛋白質，當納米顆粒進入生物環境時，會在納米顆粒周圍形成 。該層可以決定納米顆粒與給定生物系統的各種成分（包括免疫細胞）的相互作用，并決定納米顆粒的藥代動力學和生物命運。
對蛋白冠的初步研究主要集中在它給納米醫學和納米毒理學帶來的挑戰 。例如，在靜態體外細胞培養環境中形成蛋白冠會耗盡培養基中必需的營養物質和蛋白質，從而導致對細胞的間接毒性 。這種消耗可能導致納米毒理學研究的錯誤結果，因為觀察到的效果可能是由于培養基成分的消耗，而不是納米顆粒本身的內在毒性。在納米醫學領域，人們寄予厚望，認為納米粒子可以用表面靶向物種（如適配體和抗體）進行工程改造，以定位人體中的特定細胞并與之相互作用。這種靶向遞送旨在將治療分子（如藥物）直接運輸到患病細胞（如癌細胞），從而最大限度地提高療效并最大限度地減少副作用。然而，在實踐中，在納米顆粒表面形成的蛋白冠通常會屏蔽這些靶向物種，導致誤靶向和治療效果降低。這種意外的掩蔽效應會損害治療的精確遞送，并降低基于納米顆粒的治療的整體效果。
蛋白冠領域的最新研究為解決各個領域的挑戰開辟了新的機會，包括納米顆粒的環境毒性、蛋白質組學和免疫學。例如，對環境中發現的納米顆粒進行蛋白冠分析可用于追蹤其途徑，為風險管理和政策制定提供重要信息，以確保納米顆粒的安全使用，并最大限度地減少其意外釋放到環境和食物鏈中。在蛋白質組學中，納米顆粒現在被用來降低血漿蛋白的復雜性，從而提高蛋白質組覆蓋率并實現生物標志物的發現。此外，操縱蛋白冠可用于調節免疫反應，為開發免疫治療劑來治療免疫系統疾病開辟了新的途徑 。在這些新興應用中，本觀點側重于蛋白冠在蛋白質組學領域的使用。利用蛋白冠可以對血漿蛋白進行更深入的分析，促進生物標志物的識別和定量，并最終為開發潛在的診斷和治療策略開辟可能性。
2 血漿蛋白質組分析的挑戰
血漿蛋白質組分析的主要挑戰是血漿中蛋白質濃度的高動態范圍。血漿中含有大量蛋白質，濃度跨越 12 個數量級，從高豐度蛋白質（如白蛋白和免疫球蛋白）到低豐度蛋白質（如細胞因子）。如此廣泛的范圍阻礙了低豐度蛋白質的檢測和定量，而低豐度蛋白質通常對診斷和治療目的具有重要意義。基于質譜 （MS） 的蛋白質組學是血漿蛋白質組學分析的主要方法，可以在大約 4-6 個數量級的濃度動態范圍內檢測蛋白質，具體取決于所使用的儀器、樣品制備工作流程、色譜和富集技術。
為了應對這一挑戰，通常采用各種技術，如樣品分離、高豐度蛋白質的去除和低豐度蛋白質的富集，以增強血漿蛋白質組的覆蓋率。 在這一領域中，使用蛋白冠是一種新興的方法，具有降低血漿蛋白復雜性的巨大潛力，因此增加了血漿中低豐度和稀有蛋白質的鑒定和定量的機會。
3 蛋白 CORONA 如何擴增血漿蛋白質組分析
3.1 到目前為止，我們知道什么？
蛋白冠可以通過選擇性地將蛋白質吸附到納米顆粒（http://www.posuichina.com/Product/8096211554.html）表面來降低血漿的復雜性（圖 1）。這種選擇性吸附主要通過消耗高豐度蛋白質和富集低豐度蛋白質來提供幫助，從而降低血漿中蛋白質濃度的高動態范圍。這允許檢測和定量低濃度的蛋白質。此外，蛋白冠形成可以通過簡化血漿樣品的分級分離和純化步驟來簡化樣品制備，從而提高工作流程的效率并獲得更可重現的結果。
圖 1
演示蛋白冠如何簡化血漿蛋白質組分析的方案。由于血漿中存在高度豐富的蛋白質（如白蛋白、血清轉鐵蛋白和結合珠蛋白）以及血漿中存在的不同蛋白質形式，因此對血漿蛋白質組進行基于質譜的蛋白質組學分析具有挑戰性。NPs 可以通過在其冠狀體中吸附血漿蛋白的特定子集及其蛋白質形式來降低蛋白質組動態范圍。此外，小分子，尤其是磷脂酰膽堿，可以大大提高吸附蛋白質的多樣性，增強血漿蛋白質組覆蓋率。磷脂酰膽堿和其他小分子可以結合白蛋白等高豐度蛋白，阻礙它們在 NP 蛋白冠的吸附。最終，通過自下而上或自上而下的蛋白質組學對血漿蛋白質組和蛋白質形式進行深度采樣，可以發現各種疾病的生物標志物，從而了解患者和個人的整體健康譜。
蛋白冠的一個主要問題是附著在納米顆粒表面的血漿蛋白數量有限，通常只有幾百個[16]。為了提高定量血漿蛋白的數量，已經提出了利用一系列具有不同物理化學性質的納米顆粒。不同類型的納米顆粒對不同的蛋白質亞群具有不同的親和力。通過使用一組具有不同物理化學性質的納米顆粒，可以顯著增加來自各種蛋白冠的定量血漿蛋白的數量，從而提供更全面的血漿蛋白質組分析。 然而，在此類方案中應用多種納米顆粒會使樣品制備過程更加勞動密集，并降低蛋白質組學分析的可重復性。
進一步提高蛋白冠中檢測到的蛋白質數量的另一種策略是在小分子（如營養物質、維生素、脂質和代謝物）與納米顆粒相互作用之前將其加標到血漿中。這些小分子可以與蛋白質相互作用，改變/阻斷它們的結合位點，并在相同的納米顆粒表面產生獨特的蛋白冠。通過使用一系列小分子，可以在給定納米顆粒的表面形成不同的蛋白冠。這種方法顯著增加了已鑒定和定量蛋白質的數量，從而提高了使用單個納米顆粒的血漿蛋白質組分析的深度。在測試的各種小分子中，在納米顆粒蛋白冠形成之前在血漿中加標磷脂酰膽堿顯著增加了檢測到的蛋白質的數量。使用數據非依賴型采集方法，單次 LC-MS 分析可以定量單個血漿樣品中多達 1436 種血漿蛋白，而單獨血漿中可定量 322 種蛋白質。磷脂酰膽堿的這種獨特能力歸因于最豐富的血漿蛋白（包括白蛋白、血清轉鐵蛋白和結合珠蛋白）的選擇性消耗。磷脂酰膽堿與此類蛋白質結合，阻礙它們與納米顆粒表面的結合。磷脂酰膽堿同時消耗高豐度蛋白質可以減小血漿蛋白質組的動態范圍，并能夠定量豐度較低的蛋白質。
除了增加定量蛋白質的數量外，這種方法還可以選擇性地分析血漿蛋白質組的各種亞群，從而降低整體復雜性并專注于特定的蛋白質組。例如，向血漿中添加膽固醇可以增強載脂蛋白與納米顆粒表面的結合。這種靶向富集允許對特定蛋白質家族進行更詳細的分析，從而有助于在給定的疾病環境中發現生物標志物。
3.2 我們如何利用蛋白電暈進一步提高蛋白冠分析的深度？
納米醫學界可以通過采用各種創新策略來顯著提高蛋白冠分析的蛋白質組學能力，這些策略應在未來的研究中得到驗證和探索。到目前為止，只有有限范圍的小分子被應用于人血漿，以利用蛋白冠提高蛋白質組覆蓋率。通過擴展這種方法，研究人員可以探索不同類型的生物分子，甚至設計特定的新分子，這些分子可以有效中和高豐度蛋白質與納米顆粒表面的相互作用。這種策略可能導致鑒定有影響力的（生物）分子，這些分子能夠進一步降低高豐度蛋白質在納米顆粒表面的優勢，從而允許吸附低豐度蛋白質。反過來，這將提高納米醫學應用中蛋白質組分析的深度。
4 核心設施之間的數據可重復性
4.1 到目前為止我們知道什么？
血漿蛋白質組學和蛋白冠研究的主要挑戰之一是不同核心設施之間缺乏可重復性。為了在蛋白冠領域解決這個問題，至關重要的是要吸取數十年工作的經驗教訓，開發可靠的樣品制備方案和統一的報告系統。這些策略包括涵蓋從蛋白冠制備到其詳細表征的整個過程的方案。然而，基于質譜的蛋白質組學對均勻包被納米顆粒結果的具體影響尚未得到徹底研究。為了強調可重復性問題的嚴重性，我們最近進行了一項調查，將相同的蛋白冠包被樣品送到 17 個不同的蛋白質組學核心設施進行分析。雖然不同核心一致檢測到的蛋白質子集相關性良好，但它們只占總定量蛋白質的一小部分 （1.8%）（即 4022 種中的 73 種）。不同設施的蛋白質組深度不同，這給不同研究內部和之間的蛋白質和生物標志物檢測帶來了偏差。此外，這種不一致性在比較獨立研究的結果方面構成了重大障礙，并突出了標準化方案和方法的必要性，以提高該領域的蛋白質組覆蓋率和可重復性。
為了解決這個可重復性問題，我們提出了兩種不同的方法。
第一種方法側重于使用具有一致參數的統一方法對原始數據分析進行標準化，包括可變修飾、酶特異性、允許的漏診切割次數和錯誤發現率閾值。通過實施這種協調分析方法，我們顯著提高了蛋白質組學數據的連貫性，提高了重現性，并將不同核心設施中一致鑒定的獨特蛋白質的百分比從 1.8% 提高到 35.3%。
第二種方法側重于協調樣品制備的工作流程。我們在內部制備肽，然后分析來自不同核心設施的相同肽消化物的 MS 數據。根據我們的初步研究結果，我們選擇了性能最佳的 Core 進行肽分析。我們還研究了使用類似儀器和標準化數據庫搜索參數和數據處理工作流程的影響。結果表明，隨著每個標準化步驟的實施，各種蛋白質組學設施的數據一致性顯著、逐步提高。
4.2 我們如何進一步應對可重復性挑戰？
科學界在蛋白冠結果可重復性方面的進展凸顯了蛋白質電暈分析中標準化程序的迫切需求，以提高研究之間的數據可靠性和可比性。鑒于不同實驗室的不同能力和資源，以及質譜和蛋白質組學領域的不斷發展，它們還引起了人們對實施這些標準的潛在挑戰的關注。展望未來，建立蛋白冠分析的通用方案對于推進納米醫學至關重要。為了實現這一目標，蛋白冠納米醫學和蛋白質組學界應與標準化機構密切合作，為的質譜分析制準定標化方案。通過采用這些標準策略，我們可以提高蛋白冠研究的一致性和可靠性，確保結果在關重要。為了實現這一目標，不同研究和實驗室之間具有可重復性和可比性。納米醫學和蛋白質組學界應與標準化機構密切合作，為
5 蛋白冠的蛋白質形式特異性測量
5.1 到目前為止，我們知道什么？
所有已發表的蛋白冠蛋白質組學研究都采用了廣泛使用的自下而上的方法，該方法通過測量蛋白質酶消化產生的肽來識別和定量蛋白質。自下而上的蛋白質組學方法高度敏感且相對成熟，可以有效地用于測量蛋白質的各種屬性，如豐度、穩定性/溶解度、氧化還原狀態和翻譯后修飾 （PTM）。然而，自下而上的蛋白質組學并不適合研究完整的蛋白質形式（圖2）。蛋白形式，顧名思義，是源自同一基因的蛋白質的不同形式，在序列（例如截短或切割）、亞型（例如剪接）和 PTM 的累積存在方面存在變化。
圖 2
顯示自下而上和自上而下的蛋白質組學之間用于表征蛋白質冠狀病毒蛋白質形態景觀的差異的方案。一種蛋白 a 位于蛋白冠中，具有四種蛋白形式。蛋白形式 （Pr1） 有一個乙酰化 （Ac） 位點;Pr2 具有一個 Ac 和一個磷酸化 （P） 位點;Pr3 有兩個 P 位點;Pr4 沒有任何 PTM。當使用自下而上的方法分析樣品時，由于樣品制備過程中的樣品損失或電噴霧電離過程中的電離效率低（例如磷酸化肽），無法識別酶處理產生的一些肽。此外，蛋白質中的某些區域不適合使用常用的蛋白酶消化。最后，自下而上的蛋白質組學通過部分 PTM 信息鑒定蛋白質組 a。無法弄清楚蛋白冠樣品中的蛋白質形式，因為多種蛋白質形式組合可以產生相同的肽庫，并且該方法無法識別所有肽和 PTM 信息。對于自上而下的蛋白質組學，在 MS 和 MS/MS 之前通過液相色譜或毛細管電泳分離完整的蛋白質形式。四種不同的蛋白質形式可以通過它們的不同質量來檢測和區分。蛋白質形式之間的質量變化為當前的 PTM 提供了信息。自上而下的蛋白質組學能夠提供蛋白質冠的蛋白質形式景觀。
已經充分證明，來自同一基因的蛋白質形式可以具有不同的生物學功能。例如，一項對選擇性剪接引起的蛋白質形式的整體功能研究表明，其中許多蛋白質形式在功能上表現為來自不同基因的不同蛋白質，而不是彼此的微小變異。以蛋白質形式特異性方式表征蛋白冠對于改善從人血漿中發現蛋白質生物標志物并開發更有效的納米藥物至關重要。
最近，我們開創了一種有效且穩定的基于 MS 的自上而下的蛋白質組學工作流程，用于測量聚苯乙烯納米顆粒與健康人血漿樣品孵育后蛋白冠中的蛋白質形式。基于 MS 的自上而下的蛋白質組學使用 MS 和串聯 MS （MS/MS）直接測量完整蛋白質，是揭示蛋白冠蛋白質形態的理想選擇（圖 2）。我們的工作流程包括：與人血漿樣品孵育后，使用去污劑溶液（即十二烷基硫酸鈉，SDS）從納米顆粒中洗脫蛋白冠，通過緩沖液交換進行蛋白質純化，以及毛細管區間電泳 （CZE）-MS [33， 34] 和 MS/MS 分析。我們的方法已成功在聚苯乙烯納米顆粒的蛋白冠中鑒定出數百種質量范圍為 3-70 kDa 的蛋白質形式。我們揭示了 20 多種蛋白質生物標志物的多種蛋白質形式，以及 PTM 、信號肽切割和/或截斷的組合。這種分析不適合自下而上的蛋白質組學分析，其中信息通常總結為包含多種可能蛋白質的“蛋白質組”（圖 2）。這些數據突出了自上而下的蛋白質組學可以為蛋白質冠的表征增加的價值。展望未來，需要做出更多努力，從自上而下的測量來提高蛋白質組覆蓋率和蛋白質形式表征的質量，尤其是大型蛋白質形式。更先進的自上而下的蛋白質組學技術具有更好的蛋白質組學樣品制備、分離、MS 檢測、氣相碎裂以及生物信息學鑒定和定量是核心。另一方面，從大量疾病相關人類血漿樣本中自上而下地測量蛋白冠，尤其是與一系列納米顆粒結合，是發現疾病特異性蛋白質形式生物標志物的下一個關鍵步驟。
5.2 自上而下的蛋白質組學如何增強我們對蛋白冠的理解？
總體而言，自上而下的蛋白質組學不如自下而上的方法發達，特別是在蛋白冠研究的背景下。盡管其意義重大，但只有少數研究探討了蛋白冠的自上而下的蛋白質組學。這種方法使納米醫學界能夠更深入地了解蛋白冠的功能及其在疾病檢測中的作用。自上而下的蛋白質組學特別有價值，因為它提供了有關蛋白質形式的詳細信息，可以揭示疾病發生和進展的潛在機制。
未來的研究應側重于利用自上而下的蛋白質組學的獨特能力來更好地定義納米顆粒的生物命運。由于蛋白質形式提供了對蛋白質功能和結構的更精確見解，因此這種方法可以幫助預測生物系統（包括免疫細胞）將如何響應納米顆粒。為了全面了解蛋白冠在診斷和治療中的應用，我們建議未來的研究旨在提高蛋白質形式表征的覆蓋率和質量。為了提高蛋白冠的蛋白質形態覆蓋率，必須付出更多努力來推進樣品制備（即從納米顆粒中洗脫蛋白冠并在自上而下的蛋白質組學測量之前進行凈化）、蛋白質形態分離的峰容量和 MS 檢測的靈敏度。例如，應探索新技術，例如溶解核心納米顆粒，以允許在納米顆粒表面完全恢復完整的蛋白質形式。此外，可以探索天然 CZE-MS 以更好地測量大蛋白質形式。為了提高蛋白質形式表征的質量，我們需要通過研究不同的片段化技術并整合自上而下和自下而上的蛋白質組學數據來提高蛋白質形式片段化的覆蓋率。 PTM 自下而上的蛋白質組學提供的豐富信息對于更準確地解釋自上而下的蛋白質組學的蛋白質形態水平數據非常有用。還需要特別注意使用自上而下的蛋白質組學進行蛋白冠研究的可重復性。必須應用從自下而上的蛋白質組學中吸取的經驗教訓，并將其應用于自上而下的方法。
應該在開發新的策略/方法上做出更多努力，以從納米顆粒表面完全去除所有蛋白質以進行自上而下的蛋白質組學分析。目前，由于納米生物界面處的復雜作用力，幾乎不可能實現從納米顆粒表面完全去除蛋白質以進行全面表征。然而，藥物遞送領域的經驗提供了潛在的解決方案。在藥物遞送中，聚合物載體通常使用對蛋白質中性的特異性溶液去除或消化，從而能夠收集和分析釋放的蛋白質。基于這一概念，制備用于更安全、更有效治療應用的個性化納米顆粒的最新進展表明，可以消化蛋白冠涂層的金納米顆粒的金核，留下柔軟的蛋白質納米殼。這種方法可以適用于蛋白質電暈的完整蛋白質組學分析。然而，必須為每種類型的納米顆粒開發量身定制的方案，以有效地消化核心材料，同時保持蛋白質外殼的完整性。這將允許對蛋白冠進行更完整和準確的分析，從而增強我們對其組成和潛在治療應用的理解。值得一提的是PuriMag公司開發的蛋白冠前處理磁珠（http://www.posuichina.com/Product/8096211554.html），具有豐富的表面特性，可以針對不同蛋白亞群的低豐度蛋白形成富集，未蛋白組學前處理研究提供了無限可能。
6 展望
蛋白冠是納米醫學和蛋白質組學交叉的關鍵因素，通過選擇性結合蛋白質提供顯著的好處。這個過程耗盡了高豐度蛋白質，從而富集了低豐度蛋白質，并促進了蛋白質組學發現生物標志物所必需的蛋白質的分析。盡管有這些好處，但蛋白冠的研究仍處于早期階段，仍然存在許多挑戰。這些研究包括了解蛋白質-納米顆粒相互作用的動力學和熱力學，預測在小分子和不同生物環境存在下蛋白冠的組成，并將這些發現轉化為臨床應用。由于雜質會在蛋白質組學數據中引入錯誤，因此該領域的另一個挑戰是開發和采用穩健的策略來確保蛋白冠保持不含蛋白質雜質 。各種類型的雜質及其處理策略已在文獻中進行了廣泛討論。
蛋白冠研究最有前途的進展之一是自上而下的蛋白質組學的整合。與更成熟的自下而上的方法不同，自上而下的蛋白質組學允許直接分析完整的蛋白質形式——蛋白質的特異性變體，可以為疾病機制和納米顆粒-細胞相互作用提供重要的見解。我們預計，隨著自上而下的蛋白質組學技術的進一步發展，以更好地覆蓋和表征蛋白質形式，蛋白冠的蛋白質形式特異性測量將徹底改變我們對生物系統中納米顆粒行為的理解，并為從人血漿中發現新的蛋白質形式生物標志物打開大門。
為了進一步提高蛋白冠在蛋白質組學應用中的能力，研究人員應該探索超越當前方法的創新策略。這包括開發新型生物分子或小分子，這些生物分子或小分子可以選擇性地調節蛋白質在納米顆粒表面的吸附，從而提高對低豐度蛋白質的檢測。此外，從納米顆粒表面完全去除蛋白質的新方法可以使用自上而下的蛋白質組學對蛋白冠進行更徹底的分析，從而更深入地了解其組成和功能。另一個有前途的途徑是探索個性化納米顆粒，它可以根據特定的生物環境或疾病狀態進行定制。通過定制納米顆粒核心和表面特性，研究人員可以創建蛋白冠，這些蛋白冠針對特定疾病指定的獨特蛋白質子集的檢測進行了優化。
蛋白質組學分析、計算建模和機器學習算法的進步對于應對這些挑戰至關重要。這些工具可以幫助破譯蛋白質和納米顆粒之間的復雜相互作用，從而在臨床環境中實現更準確的預測和定制應用。
最近在蛋白冠領域引入的實際因果關系（即特定事件或條件之間的精確因果關系）的概念將提供更精確的理解影響蛋白質電暈組成的因素。這些因素包括納米顆粒的物理化學性質，例如大小、形狀和電荷、等離子體來源和生物環境。
擴大實際因果關系在蛋白質電暈研究中的應用可以促進高通量預測能力的發展，從而允許為特定應用量身定制的納米顆粒的精確設計。這種方法可以顯著提高基于納米顆粒的診斷和治療在不同疾病環境中的有效性和特異性。
隨著對蛋白冠的理解加深，它與個性化醫學和高級診斷的整合變得越來越可行。通過利用自上而下的蛋白質組學提供的獨特蛋白質組學圖譜，研究人員可以為個體患者開發更精確的診斷工具和治療策略。這種方法可以識別新的生物標志物并開發更有效且副作用更少的靶向治療方法。
總之，蛋白冠研究的未來在于蛋白質組學技術的持續進步、方法的標準化以及突破當前知識界限的創新策略的探索。通過解決這些關鍵領域，科學界可以釋放蛋白質冠蛋白質組學的全部潛力，為納米醫學、疾病檢測和個性化醫療保健的突破性發現鋪平道路。
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