蛋白冠在推進血漿蛋白質(zhì)組學(xué)中的作用
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The role of protein corona in advancing plasma proteomics
Amir Ata Saei, Liangliang Sun, Morteza Mahmoudi
First published: 02 September 2024 https://doi.org/10.1002/pmic.202400028
摘要
蛋白冠是生物環(huán)境中圍繞納米顆粒形成的生物分子層，嚴(yán)重影響納米顆粒與生物系統(tǒng)的相互作用，影響藥代動力學(xué)和生物結(jié)果。最初，蛋白冠給納米醫(yī)學(xué)和納米毒理學(xué)帶來了挑戰(zhàn)，例如細(xì)胞培養(yǎng)物中的營養(yǎng)消耗和納米顆粒的靶向遮蔽。然而，最近的進展凸顯了它在環(huán)境毒性、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)方面的潛力。該觀點側(cè)重于利用蛋白冠來提高血漿蛋白質(zhì)組分析的深度，解決血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動態(tài)范圍帶來的挑戰(zhàn)。蛋白冠簡化了樣品制備，富集了低豐度蛋白質(zhì)，并提高了蛋白質(zhì)組覆蓋率。創(chuàng)新包括使用不同的納米顆粒和加標(biāo)小分子來增加定量蛋白質(zhì)的數(shù)量。核心設(shè)施的可重復(fù)性問題需要標(biāo)準(zhǔn)化的方案。此外，自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)可實現(xiàn)蛋白質(zhì)形式特異性測量，從而更深入地了解蛋白冠的組成。未來的研究應(yīng)旨在改進自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，并將蛋白冠研究和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，以實現(xiàn)個性化醫(yī)療和高級診斷。1 引言
蛋白冠是一層生物分子，主要是蛋白質(zhì)，當(dāng)納米顆粒進入生物環(huán)境時，會在納米顆粒周圍形成。該層可以決定納米顆粒與給定生物系統(tǒng)的各種成分（包括免疫細(xì)胞）的相互作用，并決定納米顆粒的藥代動力學(xué)和生物命運。對蛋白冠的初步研究主要集中在它給納米醫(yī)學(xué)和納米毒理學(xué)帶來的挑戰(zhàn)。例如，在靜態(tài)體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中形成蛋白冠會耗盡培養(yǎng)基中必需的營養(yǎng)物質(zhì)和蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致對細(xì)胞的間接毒性。這種消耗可能導(dǎo)致納米毒理學(xué)研究的錯誤結(jié)果，因為觀察到的效果可能是由于培養(yǎng)基成分的消耗，而不是納米顆粒本身的內(nèi)在毒性。在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人們寄予厚望，認(rèn)為納米粒子可以用表面靶向物種（如適配體和抗體）進行工程改造，以定位人體中的特定細(xì)胞并與之相互作用。這種靶向遞送旨在將治療分子（如藥物）直接運輸?shù)交疾〖?xì)胞（如癌細(xì)胞），從而最大限度地提高療效并最大限度地減少副作用。然而，在實踐中，納米顆粒表面蛋白冠的形成通常會屏蔽這些靶向作用，導(dǎo)致錯誤靶向和治療效果降低。這種意外的掩蔽效應(yīng)會損害治療的精確遞送，并降低基于納米顆粒的治療的整體效果。
蛋白冠領(lǐng)域的最新研究為解決各個領(lǐng)域的挑戰(zhàn)開辟了新的機會，包括納米顆粒的環(huán)境毒性、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫學(xué)。例如，對環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的納米顆粒進行蛋白冠分析可用于追蹤其途徑，為風(fēng)險管理和政策制定提供重要信息，以確保納米顆粒的安全使用，并最大限度地減少其意外釋放到環(huán)境和食物鏈中。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，納米顆粒現(xiàn)在被用來降低血漿蛋白的復(fù)雜性，從而提高蛋白質(zhì)組覆蓋率并實現(xiàn)生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。此外，操縱蛋白冠可用于調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，為開發(fā)免疫治療劑來治療免疫系統(tǒng)疾病開辟了新的途徑。在這些新興應(yīng)用中，本觀點側(cè)重于蛋白冠在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的使用。利用蛋白冠可以對血漿蛋白進行更深入的分析，促進生物標(biāo)志物的識別和定量，并最終為開發(fā)潛在的診斷和治療策略開辟可能性。
2 血漿蛋白質(zhì)組分析的挑戰(zhàn)
血漿蛋白質(zhì)組分析的主要挑戰(zhàn)是血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動態(tài)范圍。血漿中含有大量蛋白質(zhì)，濃度跨越 12 個數(shù)量級，從高豐度蛋白質(zhì)（如白蛋白和免疫球蛋白）到低豐度蛋白質(zhì)（如細(xì)胞因子）。如此寬的范圍阻礙了低豐度蛋白質(zhì)的檢測和定量，而低豐度蛋白質(zhì)通常對診斷和治療目的具有重要意義。基于質(zhì)譜 （MS） 的蛋白質(zhì)組學(xué)是血漿蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要方法，可以在大約 4-6 個數(shù)量級的濃度動態(tài)范圍內(nèi)檢測蛋白質(zhì)，具體取決于所使用的儀器、樣品制備工作流程、色譜和富集技術(shù)。
為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，通常采用各種技術(shù)，如樣品分離、高豐度蛋白質(zhì)的去除和低豐度蛋白質(zhì)的富集，以增強血漿蛋白質(zhì)組的覆蓋率。 在這一領(lǐng)域中，使用蛋白冠是一種新興的方法，具有降低血漿蛋白復(fù)雜性的巨大潛力，因此增加了血漿中低豐度和稀有蛋白質(zhì)的鑒定和定量的機會。
3 蛋白冠如何擴增血漿蛋白質(zhì)組分析
3.1 到目前為止，我們知道什么？
蛋白冠可以通過選擇性地將蛋白質(zhì)吸附到納米顆粒表面來降低血漿的復(fù)雜性（圖 1）。這種選擇性吸附主要通過消耗高豐度蛋白質(zhì)和富集低豐度蛋白質(zhì)來提供幫助，從而降低血漿中蛋白質(zhì)濃度的高動態(tài)范圍。這允許檢測和定量低濃度的蛋白質(zhì)。此外，蛋白冠形成可以通過簡化血漿樣品的分級分離和純化步驟來簡化樣品制備，從而提高工作流程的效率并獲得更可重現(xiàn)的結(jié)果。
圖1. 演示蛋白冠如何簡化血漿蛋白質(zhì)組分析的方案。
由于血漿中存在高度豐富的蛋白質(zhì)（如白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白）以及血漿中存在的不同蛋白質(zhì)形式，因此對血漿蛋白質(zhì)組進行基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析具有挑戰(zhàn)性。納米顆粒可以通過在其蛋白冠中吸附血漿蛋白的特定子集及其蛋白質(zhì)形式來降低蛋白質(zhì)組動態(tài)范圍。此外，小分子，尤其是磷脂酰膽堿，可以大大提高吸附蛋白質(zhì)的多樣性，增強血漿蛋白質(zhì)組覆蓋率。磷脂酰膽堿和其他小分子可以結(jié)合白蛋白等高豐度蛋白，阻礙它們在納米顆粒蛋白冠的吸附。最終，通過自下而上或自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)對血漿蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)形式進行深度采樣，可以發(fā)現(xiàn)各種疾病的生物標(biāo)志物，從而了解患者和個人的整體健康譜。 廈門普睿邁格生物科技有限公司的蛋白冠磁珠為蛋白冠分析提供策略化工具。
蛋白冠的一個主要問題是附著在納米顆粒表面的血漿蛋白數(shù)量有限，通常只有幾百個。為了提高定量血漿蛋白的數(shù)量，已經(jīng)提出了利用一系列具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的納米顆粒。不同類型的納米顆粒對不同的蛋白質(zhì)亞群具有不同的親和力。通過使用一組具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的納米顆粒，可以顯著增加來自各種蛋白冠的定量血漿蛋白的數(shù)量，從而提供更全面的血漿蛋白質(zhì)組分析。 然而，在此類方案中應(yīng)用多種納米顆粒會使樣品制備過程更加冗繁，并降低蛋白質(zhì)組學(xué)分析的可重復(fù)性。
進一步提高蛋白冠中檢測到的蛋白質(zhì)數(shù)量的另一種策略是在小分子（如營養(yǎng)物質(zhì)、維生素、脂質(zhì)和代謝物）與納米顆粒相互作用之前將其加標(biāo)到血漿中。這些小分子可以與蛋白質(zhì)相互作用，改變/阻斷它們的結(jié)合位點，并在相同的納米顆粒表面產(chǎn)生獨特的電暈。通過使用一系列小分子，可以在給定納米顆粒的表面形成不同的蛋白冠。這種方法顯著增加了已鑒定和定量蛋白質(zhì)的數(shù)量，從而提高了使用單個納米顆粒的血漿蛋白質(zhì)組分析的深度。在測試的各種小分子中，在納米顆粒電暈形成之前在血漿中加標(biāo)磷脂酰膽堿顯著增加了檢測到的蛋白質(zhì)的數(shù)量。使用數(shù)據(jù)非依賴型采集方法，單次 LC-MS 分析可以定量單個血漿樣品中多達(dá) 1436 種血漿蛋白，而單獨血漿中可定量 322 種蛋白質(zhì)。磷脂酰膽堿的這種獨特能力歸因于最豐富的血漿蛋白（包括白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白）的選擇性消耗。磷脂酰膽堿與此類蛋白質(zhì)結(jié)合，阻礙它們與納米顆粒表面的結(jié)合。磷脂酰膽堿同時消耗高豐度蛋白質(zhì)可以減小血漿蛋白質(zhì)組的動態(tài)范圍，并能夠定量豐度較低的蛋白質(zhì)。除了增加定量蛋白質(zhì)的數(shù)量外，這種方法還可以選擇性地分析血漿蛋白質(zhì)組的各種亞群，從而降低整體復(fù)雜性并專注于特定的蛋白質(zhì)組。例如，向血漿中添加膽固醇可以增強載脂蛋白與納米顆粒表面的結(jié)合。這種靶向富集允許對特定蛋白質(zhì)家族進行更詳細(xì)的分析，從而有助于在給定的疾病環(huán)境中發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物。
3.2 我們?nèi)绾卫玫鞍坠谶M一步提高蛋白冠分析的深度？
納米醫(yī)學(xué)界可以通過采用各種創(chuàng)新策略來顯著提高蛋白冠分析的蛋白質(zhì)組學(xué)能力，這些策略應(yīng)在未來的研究中得到驗證和探索。到目前為止，只有有限范圍的小分子被應(yīng)用于人血漿，以利用蛋白冠提高蛋白質(zhì)組覆蓋率。通過擴展這種方法，研究人員可以探索不同類型的生物分子，甚至設(shè)計特定的新分子，這些分子可以有效中和高豐度蛋白質(zhì)與納米顆粒表面的相互作用。這種策略可能導(dǎo)致鑒定有影響力的（生物）分子，這些分子能夠進一步降低高豐度蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的優(yōu)勢，從而允許吸附低豐度蛋白質(zhì)。反過來，這將提高納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用中蛋白質(zhì)組分析的深度。
4 核心設(shè)施之間的數(shù)據(jù)可重復(fù)性
4.1 到目前為止我們知道什么？
血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白冠研究的主要挑戰(zhàn)之一是不同核心設(shè)施之間缺乏可重復(fù)性。為了在蛋白冠領(lǐng)域解決這個問題，至關(guān)重要的是要吸取數(shù)十年工作的經(jīng)驗教訓(xùn)，開發(fā)可靠的樣品制備方案和統(tǒng)一的報告系統(tǒng)。這些策略包括涵蓋從蛋白冠制備到其詳細(xì)表征的整個過程的方案。然而，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)對均勻包被納米顆粒結(jié)果的具體影響尚未得到徹底研究。為了強調(diào)可重復(fù)性問題的嚴(yán)重性，我們最近進行了一項調(diào)查，將相同的蛋白冠包被樣品送到 17 個不同的蛋白質(zhì)組學(xué)核心設(shè)施進行分析。雖然不同核心一致檢測到的蛋白質(zhì)子集相關(guān)性良好，但它們只占總定量蛋白質(zhì)的一小部分 （1.8%）（即 4022 種中的 73 種）。不同設(shè)施的蛋白質(zhì)組深度不同，這給不同研究內(nèi)部和之間的蛋白質(zhì)和生物標(biāo)志物檢測帶來了偏差。此外，這種不一致在比較獨立研究的結(jié)果時構(gòu)成了重大障礙，并突出了標(biāo)準(zhǔn)化方案和方法的必要性，以提高該領(lǐng)域的蛋白質(zhì)組覆蓋率和可重復(fù)性。
為了解決這個可重復(fù)性問題，我們提出了兩種不同的方法。第一種方法側(cè)重于使用具有一致參數(shù)的統(tǒng)一方法對原始數(shù)據(jù)分析進行標(biāo)準(zhǔn)化，包括可變修飾、酶特異性、允許的漏診切割次數(shù)和錯誤發(fā)現(xiàn)率閾值。通過實施這種協(xié)調(diào)分析方法，我們顯著提高了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的連貫性，提高了重現(xiàn)性，并將不同核心設(shè)施中一致鑒定的獨特蛋白質(zhì)的百分比從 1.8% 提高到 35.3%。
第二種方法側(cè)重于協(xié)調(diào)樣品制備的工作流程。我們在內(nèi)部制備肽，然后分析來自不同核心設(shè)施的相同肽消化物的 MS 數(shù)據(jù)。根據(jù)我們的初步研究結(jié)果，我們選擇了性能最佳的 核心設(shè)施進行肽分析。我們還研究了使用類似儀器和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫搜索參數(shù)和數(shù)據(jù)處理工作流程的影響。結(jié)果表明，隨著每個標(biāo)準(zhǔn)化步驟的實施，各種蛋白質(zhì)組學(xué)設(shè)施的數(shù)據(jù)一致性顯著、逐步提高。
4.2 我們?nèi)绾芜M一步應(yīng)對可重復(fù)性挑戰(zhàn)？
科學(xué)界在蛋白冠結(jié)果可重復(fù)性方面的進展，凸顯了蛋白冠分析中標(biāo)準(zhǔn)化程序的迫切需求，以提高研究之間的數(shù)據(jù)可靠性和可比性。鑒于不同實驗室的不同能力和資源，以及質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，它們還引起了人們對實施這些標(biāo)準(zhǔn)的潛在挑戰(zhàn)的關(guān)注。展望未來，建立蛋白冠分析的通用方案對于推進納米醫(yī)學(xué)至關(guān)重要。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，納米醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)界應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)化機構(gòu)密切合作，為蛋白冠的質(zhì)譜分析制定標(biāo)準(zhǔn)化方案。通過采用這些標(biāo)準(zhǔn)策略，我們可以提高蛋白冠研究的一致性和可靠性，確保結(jié)果在不同研究和實驗室之間具有可重復(fù)性和可比性。
5 蛋白冠的蛋白質(zhì)形式特異性測量
5.1 到目前為止，我們知道什么？
所有已發(fā)表的蛋白冠蛋白質(zhì)組學(xué)研究都采用了廣泛使用的自下而上的方法，該方法通過測量蛋白質(zhì)酶消化產(chǎn)生的肽來識別和定量蛋白質(zhì)。自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)方法高度敏感且相對成熟，可以有效地用于測量蛋白質(zhì)的各種屬性，如豐度、穩(wěn)定性/溶解度、氧化還原狀態(tài)和翻譯后修飾 （PTM）。然而，自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)并不適合研究完整的蛋白質(zhì)形式圖2）。蛋白形式，顧名思義，是源自同一基因的蛋白質(zhì)的不同形式，在序列（例如截短或切割）、亞型（例如剪接）和 PTM 的累積存在方面存在變化。
圖 2 顯示自下而上和自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)之間用于表征蛋白質(zhì)冠狀病毒蛋白質(zhì)形態(tài)景觀的差異的方案。
一種蛋白 a 位于蛋白冠中，具有四種蛋白形式。蛋白形式 （Pr1） 有一個乙酰化 （Ac） 位點;Pr2 具有一個 Ac 和一個磷酸化 （P） 位點;Pr3 有兩個 P 位點;Pr4 沒有任何 PTM。當(dāng)使用自下而上的方法分析樣品時，由于樣品制備過程中的樣品損失或電噴霧電離過程中的電離效率低（例如磷酸化肽），無法鑒定酶處理產(chǎn)生的一些肽。此外，蛋白質(zhì)中的某些區(qū)域不適合使用常用的蛋白酶消化。最后，自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)通過部分 PTM 信息鑒定蛋白質(zhì)組 a。無法弄清楚蛋白冠樣品中的蛋白質(zhì)形式，因為多種蛋白質(zhì)形式組合可以產(chǎn)生相同的肽庫，并且該方法無法識別所有肽和 PTM 信息。對于自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)，在 MS 和 MS/MS 之前通過液相色譜或毛細(xì)管電泳分離完整的蛋白質(zhì)形式。四種不同的蛋白質(zhì)形式可以通過它們的不同質(zhì)量來檢測和區(qū)分。蛋白質(zhì)形式之間的質(zhì)量變化為當(dāng)前的 PTM 提供了信息。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)能夠提供蛋白質(zhì)冠的蛋白質(zhì)形式景觀。 廈門普睿邁格生物科技有限公司的蛋白冠磁珠為蛋白冠分析提供策略化工具。
已經(jīng)充分證明，來自同一基因的蛋白質(zhì)形式可以具有不同的生物學(xué)功能。例如，一項對選擇性剪接引起的蛋白質(zhì)形式的整體功能研究表明，其中許多蛋白質(zhì)形式在功能上表現(xiàn)為來自不同基因的不同蛋白質(zhì)，而不是彼此的微小變異。以蛋白質(zhì)形式特異性方式表征蛋白冠對于改善從人血漿中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物并開發(fā)更有效的納米藥物至關(guān)重要。最近，我們開創(chuàng)了一種有效且穩(wěn)定的基于 MS 的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，用于測量聚苯乙烯納米顆粒與健康人血漿樣品孵育后蛋白冠中的蛋白質(zhì)形式。基于 MS 的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)使用 MS 和串聯(lián) MS （MS/MS）直接測量完整蛋白質(zhì)，是揭示蛋白冠蛋白質(zhì)形態(tài)的理想選擇（圖 2）。我們的工作流程包括：與人血漿樣品孵育后，使用去污劑溶液（即十二烷基硫酸鈉，SDS）從納米顆粒中洗脫蛋白冠，通過緩沖液交換進行蛋白質(zhì)純化，以及毛細(xì)管區(qū)間電泳 （CZE）-MS 和 MS/MS 分析。我們的方法已成功在聚苯乙烯納米顆粒的蛋白冠中鑒定出數(shù)百種質(zhì)量范圍為 3-70 kDa 的蛋白質(zhì)形式。我們揭示了 20 多種蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的多種蛋白質(zhì)形式，以及 PTM 、信號肽切割和/或截斷的組合。這種分析不適合自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中信息通常總結(jié)為包含多種可能蛋白質(zhì)的“蛋白質(zhì)組”（圖 2）。這些數(shù)據(jù)突出了自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)可以為蛋白質(zhì)冠狀病毒的表征增加的價值。展望未來，需要做出更多努力，從自上而下的測量來提高蛋白質(zhì)組覆蓋率和蛋白質(zhì)形式表征的質(zhì)量，尤其是大型蛋白質(zhì)形式。更先進的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有更好的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備、分離、MS 檢測、氣相碎裂以及生物信息學(xué)鑒定和定量是核心。另一方面，從大量疾病相關(guān)人類血漿樣本中自上而下地測量蛋白冠，尤其是與一系列納米顆粒結(jié)合，是發(fā)現(xiàn)疾病特異性蛋白質(zhì)形式生物標(biāo)志物的下一個關(guān)鍵步驟。
5.2 自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)如何增強我們對蛋白冠的理解？
總體而言，自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)不如自下而上的方法發(fā)達(dá)，特別是在蛋白冠研究的背景下。盡管其意義重大，但只有少數(shù)研究探討了蛋白質(zhì)冠狀病毒的自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)。這種方法使納米醫(yī)學(xué)界能夠更深入地了解蛋白冠的功能及其在疾病檢測中的作用。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)特別有價值，因為它提供了有關(guān)蛋白質(zhì)形式的詳細(xì)信息，可以揭示疾病發(fā)生和進展的潛在機制。
未來的研究應(yīng)側(cè)重于利用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的獨特能力來更好地定義納米顆粒的生物命運。由于蛋白質(zhì)形式提供了對蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的更精確見解，因此這種方法可以幫助預(yù)測生物系統(tǒng)（包括免疫細(xì)胞）將如何響應(yīng)納米顆粒。為了全面了解蛋白冠在診斷和治療中的應(yīng)用，我們建議未來的研究旨在提高蛋白質(zhì)形式表征的覆蓋率和質(zhì)量。為了提高蛋白冠的蛋白質(zhì)形態(tài)覆蓋率，必須付出更多努力來推進樣品制備（即從納米顆粒中洗脫蛋白質(zhì)冠狀并在自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)測量之前進行凈化）、蛋白質(zhì)形態(tài)分離的峰容量和 MS 檢測的靈敏度。例如，應(yīng)探索新技術(shù)，例如溶解核心納米顆粒，以允許在納米顆粒表面完全恢復(fù)完整的蛋白質(zhì)形式。此外，可以探索天然 CZE-MS 以更好地測量大蛋白質(zhì)形式。為了提高蛋白質(zhì)形式表征的質(zhì)量，我們需要通過研究不同的片段化技術(shù)并整合自上而下和自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)來提高蛋白質(zhì)形式片段化覆蓋率。 PTM 自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)提供的豐富信息對于更準(zhǔn)確地解釋自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的蛋白質(zhì)形態(tài)水平數(shù)據(jù)非常有用。還需要特別注意使用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)進行蛋白冠研究的可重復(fù)性。必須應(yīng)用從自下而上的蛋白質(zhì)組學(xué)中吸取的經(jīng)驗教訓(xùn)，并將其應(yīng)用于自上而下的方法。
應(yīng)該在開發(fā)新的策略/方法上做出更多努力，以從納米顆粒表面完全去除所有蛋白質(zhì)以進行自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。目前，由于納米生物界面處的復(fù)雜作用力，幾乎不可能實現(xiàn)從納米顆粒表面完全去除蛋白質(zhì)以進行全面表征。然而，藥物遞送領(lǐng)域的經(jīng)驗提供了潛在的解決方案。在藥物遞送中，聚合物載體通常使用對蛋白質(zhì)中性的特異性溶液去除或消化，從而能夠收集和分析釋放的蛋白質(zhì)。基于這一概念，制備用于更安全、更有效治療應(yīng)用的個性化納米顆粒的最新進展表明，可以消化蛋白冠涂層的金納米顆粒的金核，留下柔軟的蛋白質(zhì)納米殼。這種方法可以適用于蛋白冠的完整蛋白質(zhì)組學(xué)分析。然而，必須為每種類型的納米顆粒開發(fā)量身定制的方案，以有效地消化核心材料，同時保持蛋白質(zhì)外殼的完整性。這將允許對蛋白冠進行更完整和準(zhǔn)確的分析，從而增強我們對其組成和潛在治療應(yīng)用的理解。
6 展望
蛋白冠是納米醫(yī)學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)交叉的關(guān)鍵因素，通過選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)提供顯著的好處。這個過程耗盡了高豐度蛋白質(zhì)，從而富集了低豐度蛋白質(zhì)，并促進了蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物所必需的蛋白質(zhì)的分析。盡管有這些好處，但蛋白冠的研究仍處于早期階段，仍然存在許多挑戰(zhàn)。這些研究包括了解蛋白質(zhì)-納米顆粒相互作用的動力學(xué)和熱力學(xué)，預(yù)測在小分子和不同生物環(huán)境存在下蛋白冠的組成，并將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。由于雜質(zhì)會在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中引入錯誤，因此該領(lǐng)域的另一個挑戰(zhàn)是開發(fā)和采用穩(wěn)健的策略來確保蛋白冠保持不含蛋白質(zhì)雜質(zhì)。各種類型的雜質(zhì)及其處理策略已在文獻(xiàn)中進行了廣泛討論。
蛋白冠研究最有前途的進展之一是自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)的整合。與更成熟的自下而上的方法不同，自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)允許直接分析完整的蛋白質(zhì)形式——蛋白質(zhì)的特異性變體，可以為疾病機制和納米顆粒-細(xì)胞相互作用提供重要的見解。我們預(yù)計，隨著自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展，以更好地覆蓋和表征蛋白質(zhì)形式，蛋白冠的蛋白質(zhì)形式特異性測量將徹底改變我們對生物系統(tǒng)中納米顆粒行為的理解，并為從人血漿中發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)形式生物標(biāo)志物打開大門。
為了進一步提高蛋白冠在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用中的能力，研究人員應(yīng)該探索超越當(dāng)前方法的創(chuàng)新策略。這包括開發(fā)新型生物分子或小分子，這些生物分子或小分子可以選擇性地調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在納米顆粒表面的吸附，從而提高對低豐度蛋白質(zhì)的檢測。此外，從納米顆粒表面完全去除蛋白質(zhì)的新方法可以使用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)對蛋白冠進行更徹底的分析，從而更深入地了解其組成和功能。另一個有前途的途徑是探索個性化納米顆粒，它可以根據(jù)特定的生物環(huán)境或疾病狀態(tài)進行定制。通過定制納米顆粒核心和表面特性，研究人員可以創(chuàng)建蛋白冠，這些蛋白冠針對特定疾病指定的獨特蛋白質(zhì)子集的檢測進行了優(yōu)化。
蛋白質(zhì)組學(xué)分析、計算建模和機器學(xué)習(xí)算法的進步對于應(yīng)對這些挑戰(zhàn)至關(guān)重要。這些工具可以幫助破譯蛋白質(zhì)和納米顆粒之間的復(fù)雜相互作用，從而在臨床環(huán)境中實現(xiàn)更準(zhǔn)確的預(yù)測和定制應(yīng)用。
最近在蛋白冠領(lǐng)域引入的實際因果關(guān)系（即特定事件或條件之間的精確因果關(guān)系）[49]的概念將提供更精確的理解影響蛋白冠組成的因素。這些因素包括納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)，例如大小、形狀和電荷、等離子體來源和生物環(huán)境。
擴大實際因果關(guān)系在蛋白冠研究中的應(yīng)用可以促進高通量預(yù)測能力的發(fā)展，從而允許為特定應(yīng)用量身定制的納米顆粒的精確設(shè)計。這種方法可以顯著提高基于納米顆粒的診斷和治療在不同疾病環(huán)境中的有效性和特異性。
隨著對蛋白冠的理解加深，它與個性化醫(yī)學(xué)和高級診斷的整合變得越來越可行。通過利用自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)提供的獨特蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜，研究人員可以為個體患者開發(fā)更精確的診斷工具和治療策略。這種方法可以識別新的生物標(biāo)志物并開發(fā)更有效且副作用更少的靶向治療方法。
總之，蛋白冠研究的未來在于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的持續(xù)進步、方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及突破當(dāng)前知識界限的創(chuàng)新策略的探索。通過解決這些關(guān)鍵領(lǐng)域，科學(xué)界可以釋放蛋白質(zhì)冠狀病毒蛋白質(zhì)組學(xué)的全部潛力，為納米醫(yī)學(xué)、疾病檢測和個性化醫(yī)療保健的突破性發(fā)現(xiàn)鋪平道路。
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