免疫磁性微球的簡介、原理與應用
免疫磁性分離技術是利用抗原抗體的高度特異性識別作用，使抗體（或抗原）固定于免疫磁性微球（IMMS）表面，形成固相抗體/抗原的復合物，經外磁場作用后，復合物被滯留，磁性微球載抗原/抗體復合物與其他組分分離,從而達到分離目的。由于磁性微球代替其他固相載體用于免疫分離，不僅簡單易行，而且特異性高，損失小，還可將免疫分離與富集結合為一體。因此它在醫學、生物分離、食品衛生檢測、環境檢測等諸多領域展現了廣闊的研究與應用前景。
一、磁性微球的簡介
1、磁性材料
磁性材料多為 Fe、Co 和 Ni等過渡金屬特定晶型的氧化物、混合氧化物及其水化物。在眾多磁性材料中，可供選擇使用的只有少數幾種：如 γ-Fe2O3，MeFe2O3（Me＝Co、Mn、Ni），Fe3O4，Ni、Co、Fe、Fe-Co 和 Ni-Fe 合金等,其飽和磁化強度依次遞增，穩定性卻依次遞減。目前最常用的磁性材料為Fe3O4磁粉或磁流體（magnetic fluid，或鐵磁流體，ferrofluid）。后者是含有超細磁性粒子（粒徑10～40nm）的混懸液，在外磁場作用下可在體內定向移動聚集，靶向性較強，并可定期、安全地排出體外。此外，磁流體可吸收交變磁場中電磁波的能量轉化為熱能，使局部溫度升高而殺傷腫瘤組織。
2、磁性微球
磁性微球按組成的材料的不同，可分為無機微球、生物高分子微球、高分子微球等。就目前國內外的研究狀況，磁性聚合物微球按結構主要分為 3 大類：A.核-殼結構，即磁性材料為核，聚合物為殼；B. 夾層結構（也稱殼-核-殼結構），即內核為聚合物，中間層為磁性材料，外層為聚合物；C. 網狀結構，即磁性材料分散于聚合物微球中（圖1）。
圖1 三種不同結構的磁性聚合物微球
A.核殼結構 B.夾層結構 C.網狀結構
磁性材料 聚合物材料
Fig 1 The three structures of magnetic polymer microsperes magnetic materials polymer materials
A. core-rind structure B. samdwich structure C. reticulation structure
Fe3O4納米粒子在粒徑小于30nm時，具有超順磁性，即在沒有外界磁場作用時，沒有磁性；而存在外界磁場作用時，則極易被磁化；外界磁場撤銷后，又會在極短的時間內退磁，沒有磁滯現象，矯頑力為零。超順磁性的出現可歸因為：在小尺寸下，當各向異性能減小到與熱運動能可相比擬時，磁化方向就不再固定在一個易磁化方向作無規律變化，結果導致超順磁性的出現。
3、聚合材料
常用的聚合物材料有白蛋白、明膠、球蛋白、酶類、聚賴氨酸、聚故氨酸、淀粉、葡聚糖、殼聚糖、阿拉伯膠、果膠、乙基纖維素、聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸等，這些材料都具有一定的通適性，對人體無毒性。
4、磁性微球必須滿足的條件
（1）超強的順磁性，就是指在磁場的存在下能迅速聚集，離開磁場能夠均勻分散，不出現聚集現象；
（2）合適的粒徑（粒徑小于30nm）且粒徑分布單分散，使微球有足夠強的磁響應性，又不會因粒徑太大而發生沉降；
（3）具有豐富的表面活性基團，以便微球可以和抗體/抗原偶聯，并在外磁場的作用下實現分離。
二、磁性微球的制備原理與方法
1、包埋法
包埋法是將磁性粒子分散于高分子聚合物溶液中，通過霧化、絮凝、沉積、蒸發等手段得到磁性聚合物微球。Gupta 等將磁性粒子與牛血清清蛋白和棉籽油進行超聲處理，然后加熱至 105～150℃，得到外包牛血清白蛋白的磁性微球；一般而言，包埋法得到的磁性微球其磁性粒子（磁核）與外殼層的結合主要通過范德華力（包括氫鍵）、磁粒表面的金屬離子與聚合物鏈的螯合作用以及磁性粒子表面功能基與聚合物殼層功能基形成的共價鍵。利用包埋法制備磁性微球方法簡單，但所得的粒子粒徑分布寬、形狀不規、粒徑不易控制、殼層中難免混雜一些諸如乳化劑之類雜質，用于免疫測定、細胞分離等領域會受到很大的限制。
2、單體聚合法
單體聚合法是在磁性粒子和單體存在下，加入引發劑、穩定劑等聚合而成的核-殼結構磁性聚合物微球。迄今為止，單體聚合法合成磁性微球的方法主要有：懸浮聚合、乳液聚合（包括無皂乳液聚合、種子聚合）、分散聚合等。單體聚合法成功的關鍵在于確保單體的聚合反應在磁粒表面順利進行。一般而言，磁性粒子為親水性，對于親水性單體如戊二醛，單體易接近磁性粒子，但對于大多數油性單體如苯乙烯、甲基丙烯酸甲脂等，據核反應則難以在磁粒表面順利進行。適當改進懸浮聚合的有機相組成，或對磁性粒子進行表面處理，可使單體在磁粒表面順利聚合。
懸浮聚合法具有微球粒徑分布寬、粒徑較大、固載量小、并有不含磁性物質空白球的缺點，但作為固定化酶的載體，有利于保持酶的活性，而且磁響應性也較強。目前來說，采用乳液聚合法難以制備出粒徑大于 1μm的磁性聚合物微球，而當磁性聚合物微球用于細胞分離、固定化載體領域時，為了能在磁場下快速分離，多希望磁性聚合物微球粒徑大于 1μm。
分散聚合法是指一種溶于有機溶劑(或水)的單體，通過聚合生成不溶于該溶劑的聚合物，而且形成膠態穩定分散體系的聚合方式，這對于合成大粒徑、單分散性的磁性聚合物微球具有得天獨厚的優勢，同時，該方法向微球表面引入功能基團很方便。
3、共沉淀法
共沉淀法是指二價與三價鐵離子在堿性條件下沉淀生成 Fe3O4 或利用氧化-還原反應生成 Fe3O4 的同時，利用聚合物材料（例如聚乙二醇、葡聚糖等）做分散劑，得到外包聚合物的磁性微球。共沉淀法得到的磁性微球通常粒徑較小（ 10nm～100nm），因而具有較大比表面積和固載量。但其含磁量低，磁響應性較弱，操作時需要較強的外加磁場[10]。
4、化學沉淀法
化學沉淀法是指將一定濃度的磁性金屬陽離子滲透和交換到大孔樹脂中去，然后利用化學反應使金屬離子轉化為磁性金屬氧化物，使之均勻分布在聚合物的孔結構中，滲透和轉化步驟可反復進行；另一種方法是將樹脂硝化，然后在酸的存在下，用硝酸將金屬（如鐵）氧化成金屬氧化物，但這樣得到的磁性微球僅限于樹脂表面。
該方法操作簡便，樹脂中磁性分布均勻，磁含量容易控制，但對樹脂的要求比較嚴格。例如用一定比例的二價和三價鐵離子溶液浸泡陽離子交換樹脂，然后將樹脂置于堿性溶液中，使鐵離子轉化為Fe3O4，這兩步操作可以反復進行。
三、免疫磁性微球的應用
1、醫學方面應用
免疫磁性微球作為靶向釋藥系統的載體，在外加磁場的作用下，將藥物載至預定區域，可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細胞接觸，提高了殺傷癌細胞的效果。Kharkevich 等將具有磁性的可溶性聚電解質與含神經肌肉麻醉劑的脂質體的磁性藥物載體，用于貓體實驗，取得了良好的效果。通過免疫磁性微球（IMMS）體外凈化骨髓已經廣泛的應用于高劑量化療后的自體骨髓移植，取得了令人鼓舞的結果。至今已經應用于幾乎所有的需要進行骨髓凈化的癌癥類型[12]。如神經母細胞、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小細胞癌、乳腺癌等。
2、生物分離方面應用
免疫磁性微球分離方式有兩種：直接法，即用抗體包被磁性粒子，再與抗原結合形成復合物，在磁場中與其它物質分離；間接法，就是先用第二抗體包被磁珠，使磁珠成為第二抗體的載體，抗原與第一抗體結合后再加入帶有第二抗體的磁珠，磁珠上的第二抗體便與第一抗體結合，形成復合物，在磁場中該復合物得到分離。
免疫磁性微球技術可用來分離人類各種細胞，如紅細胞、外周血嗜酸/堿性粒細胞，神經干細胞，造血細胞、T淋巴細胞及多種腫瘤細胞等。在骨髓移植（BMT）的臨床實踐中，曾采用免疫磁性微球去除自體骨髓移植物中殘存癌細胞以降低白血病復發的機會，同樣的方法用于選擇性去除異體骨髓移植物中T細胞以防治移植抗宿主病（GVHD）的發生。免疫磁性微球在細胞分離方面還廣泛應用于：分離純化特定細胞，進行生理病理研究；用于白血病、艾滋病的治療；造血干細胞的分離純化以及遺傳病和腫瘤的基因治療等等。
此外，Nakamura 等把細菌磁微球用于分離血清中免疫球蛋白 IgG 的含量。 Fabregas 等將 IMMS 用磁場固定在一個平板換能器上，制得一種新型免疫傳感器，并將其應用于流動分析系統，能夠分離出樣品中微摩爾級濃度的兔抗 IgG。
3、食品衛生檢測方面應用
免疫磁性分離技術不但廣泛應用于醫學、生物學的各個領域，而且在食品衛生檢測方面的應用也初見端倪。沙門氏菌是引起食物中毒最常見的菌屬之一。Skjerve 等報道了用免疫磁性分離技術從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌，其檢測限為每克 1×102 個細菌。Seo 等將 FIA 與免疫磁性分離結合，測定接種于牛肉、蘋果汁和生牛奶中的低濃度大腸桿菌，每克牛肉中僅有 4 個大腸桿菌即可被檢出。可見將免疫磁性分離技術和其它檢驗方法，如酶聯免疫吸附分析（ELISA），多聚酶鏈式反應（PCR），熒光免疫分析（FIA），電子化學發光（ECL）相結合，可以數倍地提高分離效率和檢測極限。
4、環境檢測方面應用
目前已經嘗試將 IMMS 引入環境監測領域，用于對環境中自然水體、工業廢水、生活污水、土壤環境中部分有毒有機物、病毒、細菌的檢測。Yu. H成功地將 IMMS 應用于快速分離食品及環境水體中的細菌和毒素，并將這種分離技術和熒光免疫分析法相結合，能夠快速探測出環境水體中 2×10-3 個/mL 的 E. coli O157，并能夠完成 96 個/h樣品的檢測。Sylvie 等研究用 IMMS 富集環境水體中的似隱菌屬擔孢子（一種能夠引起腸胃疾病的原生動物），然后采用 PCR 擴增檢測技術進行檢測，其檢測靈敏度達到能夠從每 100L水中檢出 1 個卵囊的水平。Lawruk 等用磁性微球酶聯免疫吸附法測定環境水樣及土壤中氰基丫嗪，同時選用 IMMS 作為 2，4-D 抗體固相，檢測環境水樣中的 2，4-D 及其酯類，該法靈敏度更高，檢出限可達 0.7μg/L。
四、小結
免疫磁性微球是免疫學與磁性微球技術結合的一類新型材料，其分離技術由于具有簡便、快速。分離純度高等優點已被廣泛用于各個領域。隨著免疫磁性分離技術的發展，必將使IMMS應用到更加廣泛的領域。目前使用IMMS技術本身已日趨成熟，以后研究方向將圍繞以下問題。
1、磁響應性與粒徑的關系
磁性微球的突出特點是其在外加磁場的作用下定向移動。未來磁性制備的目標是獲得高磁響應性、高比表面積、低密度、單分散的微球，或者尋求新的磁性材料作為磁核以及對磁核的特殊處理能有助于解決這一問題。
2、特定的抗原-抗體結合物
對于特定的抗原/抗體的快速分離與檢測，找到對應的、具有最強親和力的抗體/抗原，使其形成穩定的抗原-抗體復合物，且不影響其空間穩定性及活性將會是未來研究的重點。
3、磁性微球的應用
磁性微球應用應解決的問題是如何避免包覆的高分子層的分解以及磁性微球的再生，增長微球的使用壽命，使其能商業化生產。
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