成功應用生物素（biotin）、親和素（avidin）和鏈霉親和素（streptavidin）的技術提示
2018-9-15 19:07:16點擊：
streptavidin-biotin 系統是天然存在的蛋白質-配體相互作用體系，已成功應用于蛋白質、核酸和脂質的檢測以及蛋白質純化。avidin-biotin系統是一種簡單而優雅的系統，通過利用來源于雞蛋白的avidin對biotin（維生素B7）的高親和力來連接免疫測定中的蛋白質。從細菌中分離的streptavidin同樣與biotin結合良好，但缺乏在avidin上發現的糖蛋白部分，因此顯示出較少的非特異性結合。在免疫測定中，用于定位或定量分析物的抗體和報告物如熒光染料或酶通常通過streptavidin/avidin-biotin偶聯。在這里，您將找到一些使用streptavidin-biotin親和系統時的有用提示。廈門普睿邁格生物技術有限公司的PuriMag G-Streptavidin和PuriMag G-Avidin在各類應用中均有非常良好的表現。
雖然avidin和Streptavidin都以非常高的親和力結合生物素，但在一些應用中使用avidin的主要問題是高非特異性結合，這歸因于糖的存在和高pI。因此，使用Streptavidin或可選地保留相同生物素結合特性的去糖基化avidin可以防止顯著的非特異性結合。
2. Streptavidin-biotin as a versatile detection system
Streptavidin-biotin系統幾乎可以引入各種免疫測定中，先將抗體與biotin綴合，而后用Avidin or Streptavidin蛋白檢測。之后將其與廉價的商業來源廣泛的高質量的各種熒光染料和酶綴合，有利于信號放大和增加靈敏度，但同時需要優化抗體和綴合物的結合。
3. Choose the right buffer system when working with biotinylated antibodies
為了防止高背景和低信噪比，強烈建議在阻斷緩沖液和其他溶液中避免胎牛血清（FBS）或生物素。良好的替代品是0.1％-2.0％BSA.在蛋白質印跡中，脫脂奶粉或酪蛋白應限于初始阻斷步驟，因為殘留的生物素會干擾測定。在這種情況下，然后應在TBS-Tween中制備抗體溶液，其與硝酸纖維素膜和PVDF膜均相容。如果背景仍然存在問題，高純度的0.2％-6％酪蛋白可以改善結果。
4. Reducing interference from residual biotin in samples
當使用Streptavidin-biotin系統時，有時可通過蛋白質印跡觀察到非特異性條帶。對于組織和細胞裂解物尤其如此，因為它們可能含有具有共價結合的生物素作為輔因子的酶。在這些情況下，在與一抗孵育之前，增加緩沖液的離子強度（~0.5M NaCl）和/或進行特定的生物素阻斷步驟是有用的。在這種情況下，通過使用PuriMag的鏈霉親和素瓊脂糖磁珠從酪蛋白中去除游離的生物素和生物素化的酶可以顯著增強靈敏度。
5. Biotinylation of cell surface for protein quantification
Streptavidin-biotin素系統可以成功地作為非侵入性技術用于化學標記細胞表面蛋白質，以直接、準確地定量細胞表面表達、內吞作用和各種質膜受體和抗原的再循環。隨后可以使用ELISA或Western印跡定量與特定受體或抗原結合的生物素的量。該技術可快速且安全的替代放射性標記的方案。
6. Protein biotinylation
當制備用于生物素標記蛋白質的試劑時，建議在研究系統下進行優化測定。這是因為選擇合適的間隔臂和將生物素與靶蛋白結合的正確化學方法可能對實驗結果產生重要的影響。蛋白質生物素化最廣泛的方法是基于用生物素的琥珀酰亞胺（NHS）酯修飾蛋白質中暴露的伯氨基。當不可能修飾游離氨基時，如果蛋白質含有游離硫醇基團或者如果它們被糖基化，則蛋白質仍然可以被生物素化。此外，還可以使用市售的光反應生物素化試劑將蛋白質生物素化，所述光反應生物素化試劑在暴露于紫外光后活化。
7. Purification of biotinylated proteins
由于Streptavidin-biotin復合物需要強變性緩沖液來破壞它們的相互作用并釋放生物素，因此從Streptavidin蛋白中純化生物素化蛋白質也會導致天然構型和功能性質的喪失。 為此，考慮使用設計用于以較低親和力結合生物素的抗生物素蛋白類似物，并允許在較溫和的條件下進行洗脫。 或者，可使用生物素的環狀胍基類似物2-亞氨基生物素（2-iminobiotin），因為它表現出與Streptavidin的pH依賴性相互作用，這也促進了在較溫和條件下的回收。 它在高pH下保持高親和力特異性結合，但在酸性pH值下相互作用很差。 或者，也可以使用具有可切割間隔臂的生物素。
8. Biotinylation including cleavable spacers
已經引入了生物素的雙環與負責進行蛋白質共價結合的化學基團之間的可切割間隔臂的使用，目的是在固定化Streptavidin蛋白上捕獲后促進生物素化蛋白質的釋放。 這些技術可容易地從商業來源獲得，包括可通過還原劑如2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇和可光裂解的連接基團破壞的二硫鍵。 然而，這些方法中的每一種都存在其自身的局限性，應該針對特定的實驗條件進行仔細優化。
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