納米粒子表面蛋白冠Corona的形成機制和關鍵影響因素分析
摘要：納米粒子作為一種新型的材料，在食品和生物醫學領域中具有廣泛的應用前景。納米粒子在生物環境中會自發地吸附蛋白質，數十甚至幾百種蛋白質在納米粒子表面會形成蛋白冠。而蛋白冠在納米粒子表面的形成則是影響其穩定性、生物相容性、靶向性以及藥物釋放性能的重要因素之一。蛋白冠的形成機制受到多種因素的影響，如納米粒子的尺寸、形狀、表面化學性質等。同時，蛋白質的種類、濃度、pH等也會對蛋白冠的形成產生影響。蛋白質的結構與其在納米粒子表面的分布密切相關，而蛋白質的構象則會影響其在納米粒子表面的結合方式和穩定性。蛋白冠在納米粒子表面形成的機制和影響因素十分復雜，需要綜合考慮多個因素的作用。了解蛋白冠的形成機制和影響因素會幫助我們理解蛋白冠的形成過程并針對特定需求來控制特定蛋白冠的形成。本文綜述了近年來對蛋白冠在納米粒子表面形成機制和影響因素的研究，以期為蛋白冠的深入研究提供理論依據。
納米粒子(nanoparticles, NPs)是至少在一個維度上尺寸小于100 nm的顆粒。NPs具有尺寸小和表面體積比高的特點，因此其具有良好的化學、電子、光學、磁性和機械性能[1]。由于NPs具有獨特的物理和化學特性，已被廣泛用于催化、電子學、生物醫學和食品領域[2]。在生物醫學和食品領域，NPs進入人體生物環境后會產生各種新的變化，對NPs表面蛋白質吸附的研究是目前的研究熱點。蛋白冠(protein corona, PC)是指納米材料在進入生物環境后(如血液、血清和細胞質等)，其表面吸附的一層或多層蛋白質所組成的結構[3]。PC一般由數十或數百種蛋白質組成。它們改變了NPs的物理化學性質，如大小、zeta電位、形態和聚集狀態。與此同時，PC還改變了NPs和生物系統之間的相互作用，并參與調節NPs的動力學、運輸和反應途徑[4]。PC分為兩種類型：松散地與NPs結合且動態較高、關聯較弱的軟冠(soft corona, SC)和與NPs緊密結合更穩定、交換更緩慢的硬冠(hard corona, HC)[5]。隨著時間的推移，先形成的SC所含蛋白質會被親和力更高的蛋白質所取代從而形成HC。PC的形成不僅受到環境中pH、時間、溫度、蛋白組成、濃度和狀態的影響，還受到NPs尺寸、形狀和表面化學性質等特征的影響[6]。所有這些因素都是相互關聯的，每個單獨的因素都對PC的組成產生重要影響。因此，理解PC在NPs表面形成機制和影響因素已成為納米材料研究的重點。認知NP的形成機制與影響因素可以幫助我們了解PC的形成，確定不同因素發揮的作用，以便在各種應用中調節控制PC的形成。納米粒子表面蛋白冠Corona的形成機制和關鍵影響因素分析，purimag Promix kit系列磁珠在血清血漿蛋白組學研究中具有重要意義（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
1 蛋白冠的形成機制及研究方法
1.1 蛋白冠的形成機制PC的形成是一個伴隨著Vroman效應的平衡過程，這種效應是指豐度較高的蛋白質首先到達并黏附在NPs的表面形成動態實體，然后被親和力較高的蛋白質取代，在多蛋白質系統中形成穩定的實體[7]。Vroman效應是一個常見的現象，其中復雜的蛋白質混合物競爭NPs的有限的表面位點，一個蛋白質可能會解吸或留下一個表面空位被其他蛋白質迅速填補。PC在NP表面形成的納米生物界面取決于原始NP的性質和環境因素，而環境控制著細胞對NPs的識別[8]。在生物環境中，由于常見的且結合不緊密的蛋白質和那些不常見的卻結合緊密的蛋白質之間存在競爭關系，PC成分會隨著時間變化而達到平衡。Nastyshyn等[9]通過研究發現在血液中形成的蛋白冠其早期吸附的成分和吸附量與晚期的不完全相同，其中，SC中發現的大多數蛋白質仍存在于HC中。高豐度和結合速度快的蛋白質會在幾秒鐘到幾分鐘內形成初始PC或SC，后期則被具有更高親和力的蛋白質取代形成HC，這個取代過程甚至可以達到幾小時[10]。HC足夠穩定，可以保持其初始狀態并存在很長時間，而SC會動態地與周圍的蛋白質交換，并隨著時間和環境的變化而變化[11]。一般來說，HC直接與NPs的表面相互作用，而SC通過弱的蛋白-蛋白相互作用與NPs相互作用[12]。但HC并不完全覆蓋NPs的表面，這就給低親和力的蛋白質提供了直接接觸NPs表面并與NPs上的某些功能團相互作用的機會[13]。 同時，組成PC的蛋白分為軟蛋白和硬蛋白，軟蛋白和硬蛋白的吸附模式明顯不同(圖1)[14]。由于硬質蛋白質不容易展開，它們的疏水結構域傾向于內部折疊，其親水性結構域分布在外部。硬蛋白的吸附主要由靜電相互作用驅動，并可能采取特定的取向，因此只有在靜電相互作用有利時才會吸附到親水表面[15]。一般來說，硬蛋白比軟蛋白更難吸附在疏水表面上。與硬蛋白相比，軟蛋白在結構上不太穩定，其吸附過程涉及多種驅動力，吸附過程更難預測[16]。目前對PC動態過程的研究大多集中在PC的構象、組成和其他隨時間變化的表面特性上[17]。由于蛋白質本身的復雜性和多樣性，只有大約20種蛋白質被明確歸類為“軟”或“硬”。大多數蛋白質，如葡萄糖氧化酶或脂肪酶，尚未被分配到特定類別，需要通過更多的實驗來確定特定的蛋白質吸附行為。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
圖1 硬蛋白和軟蛋白的吸附差異[14]
1.2 蛋白冠的研究方法
對PC的現有研究方法如圖2所示，主要分為直接方法和間接方法[18]。直接方法主要包括使用各種技術直接分析吸附在NPs表面的蛋白質，如透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)、凝膠電泳(gel electrophoresis, GE)、質譜法(mass spectrometry, MS)和電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)等。這些方法提供了關于吸附蛋白質特性和數量的信息，但通常需要從過量的蛋白質中提純，并且會對PC結構造成一定的破壞。在直接方法中，還可以使用圓二色譜(circular dichroism, CD)、傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)等技術，用于研究PC的結構變化，但這些方法不能提供關于蛋白質的定量信息。另一方面，間接方法通過測量底層NPs性能的變化來研究PC。這些方法包括測量NPs尺寸的增加，如TEM、AFM、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)、納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)和動態光散射(dynamic light scattering, DLS)等；NPs在矩陣中的移動，如GE、差速離心沉降(differential centrifugal sedimentation, DCS)等；NPs表面電荷的變化，如激光多普勒風速測定(laser Doppler anemometry, LDA)、可調電阻脈沖傳感(tunable resistance pulse sensing, TRPS)和毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)等；NPs的常見性能測定，如熒光相關光譜(fluorescence correlation spectroscopy, FCS)、紫外可見吸收光譜(ultraviolet- visible absorption spectroscopy, UV-Vis)、等溫滴定量熱法(isothermal titrimetric calorimetry, ITC)、石英晶體微天平(quartz crystal microbalance, QCM)和懸浮微通道諧振器(suspend microchannel resonator, SMR)的測量等。
圖2 PC現有研究方法[18]
這些方法可以從不同角度深入研究PC的形成，探討NPs和蛋白質之間的相互作用。通過直接方法，能夠深入了解吸附蛋白質的特性和數量，但需要注意結構破壞和提純過程可能導致失去部分信息。而間接方法通過測量底層NPs性能的變化，為我們提供了更全面的了解PC形成的途徑，涵蓋了尺寸變化、表面電荷變化、熒光特性等多個方面。這些方法的綜合運用可以促進對PC形成機制的深刻理解，為NPs在生物體內的應用提供有力支持。
2 蛋白冠形成的影響因素
了解影響PC形成的影響因素能夠幫助我們更好地認知PC的形成過程，并根據需求來調節PC的特性。影響因素包括：NPs的特性，如尺寸、形狀、濃度、機械性能和表面化學性質；NPs的孵化環境條件，如時間、溫度、pH值和蛋白質組成等；NPs與蛋白質之間的相互作用力，如疏水作用、靜電作用、范德華力、氫鍵和π?π作用。一般來說，PC的形成是NPs、蛋白質分子和外部條件的綜合因素的結果，需要進行定性和定量分析來確定與蛋白質和NPs之間的相互作用有關的主要因素，從而為理解PC的形成提供理論和實驗基礎。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
2.1 納米粒子特性對蛋白冠形成的影響
2.1.1 納米粒子的尺寸對蛋白冠形成的影響
首先，NPs的大小決定了表面曲率、空間位阻和可用于蛋白質結合的表面積，從而影響蛋白質的吸附量。NPs的尺寸對PC的形成有很大程度的影響，蛋白質的吸附會隨NPs的尺寸變化而發生改變。Abdelkhaliq等[19]通過液相色譜-質譜串聯法得到50 nm與200 nm聚苯乙烯納米粒子(polystyrene nanoparticles, PS NPs)的蛋白質單位面積吸附比為1:1.2?1:2.0；結果表明，尺寸更大的NPs具有更大的表面積，導致空間位阻和表面曲率更小，為蛋白質提供了更合適的結合位點。Marichal等[20]使用不同尺寸的二氧化硅納米粒子(SiO2 nanoparticles, SiO2NPs)與可溶性酵母蛋白提取物相互作用，以吸附等溫線作為指標發現尺寸大的NPs在單位表面上吸附了更多的蛋白質。Kihara等[21]通過蛋白質的吸附動力學發現顆粒尺寸越小，動力學演變越快且蛋白質層越薄。不同種類NPs的尺寸效應也會對蛋白吸附量產生不同的影響。Huber等[22]研究了CeO2和TiO2NPs在不同介質和條件下的蛋白吸附量，結果表明當NPs粒徑小于25 nm時，具有最大的表面積/質量比，吸附的蛋白數量最多。Partikel等[23]通過考馬斯亮藍蛋白質測定法來量化聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA]基NPs堿水解后的總吸附蛋白質量，結果表明在100?200 nm范圍內，蛋白質在PLGA-NP和聚乙二醇-聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid)-polyethylene glycol, PLGA-PEG]基NPs上的吸附并不取決于NPs的大小。
此外，NPs的大小也會影響PC的類型和組成。Zhao等[24]使用聚丙烯酰胺凝膠電泳和液相色譜-質譜/質譜法確定了血液中銀納米粒子(Ag nanoparticles, AgNPs)的主要結合蛋白為人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)，通過表面積和濃度來研究AgNPs曲率對形成PC的影響；結果表明AgNPs與半胱氨酸和胱氨酸相互作用，破壞了HSA的二級結構與空間構象，而且這種作用在尺寸小的AgNPs上比大的AgNPs更強。PC顯著減輕了AgNPs的毒性并減少了AgNPs的細胞內化，在相同的面積濃度下，較大的顆粒會有更明顯的抑制作用。NPs的尺寸還會對PC的形態和結合位置造成影響。Sajib等[25]采用了分子動力學模擬來研究不同尺寸金納米粒子(Au nanoparticles, AuNPs)上的卵磷脂和溶菌酶PC。MD結果表明PC結構取決于蛋白質類型和NPs的大小。NPs尺寸的減少會導致蛋白質吸附方向的角度自由度增加，與溶菌酶在AuNPs表面的不均勻多層聚集相比，卵磷脂蛋白形成均勻的單層吸附(圖3)。2.1.2 納米粒子的形狀對蛋白冠形成的影響NPs的形狀對吸附在NPs表面的蛋白質的數量和類型有很大影響。Visalakshan等[26]制備了兩種性質相同的球體和棒狀介孔SiO2NPs。研究結果表明，在血漿和血清中附著在棒狀SiO2NPs上的蛋白質數量遠高于球狀SiO2NPs。SiO2NPs對白蛋白、纖維蛋白原和免疫球蛋白的吸附存在形狀依賴性差異，NPs的形狀是免疫系統用于識別和清除外來實體的特定蛋白質的關鍵因素。Kuschnerus等[27]采用散射、成像和蛋白質表征技術的組合來評估不同形狀對SiO2NPs表面PC的影響。結果表明，特定的蛋白質吸附概況高度依賴于暴露的面積和長寬比。如圖4所示，球形NPs (AMS-6S)形成相對均勻的SC和HC且白蛋白含量較高，而棒狀NPs (SBA-15)和刻面狀NPs (AMS-6F)擁有與外表面結合較弱的SC，并在更大程度上受到顆粒形態的影響。Bewersdorff等[28]使用了4種不同形狀(球體、棒狀、星狀和籠狀)的AuNPs在人血清中進行孵化，通過液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜鑒定蛋白質，并比較其相對豐度。圖5所示的結果表明AuNPs的形狀比表面電荷具有更大的影響。特別是籠狀的AuNPs顯示出較低的總蛋白量，與其他形狀相比，納米籠可以提供更好的生物相容性，因為高曲率區域和平面上的密集連接可能會阻礙免疫系統的滲透和清除。
圖3 卵磷脂蛋白與溶菌酶AuNPs表面形成PC的對比[25]
2.1.3 納米粒子的表面化學性質對蛋白冠形成的影響
NPs的表面電荷和疏水特性可以通過不同的表面化學修飾來改變，從而反過來影響PC的類型和NPs吸附蛋白質的數量。一般來說，蛋白質同時具有疏水性和親水性結構，在納米材料存在的情況下，這些結構可以在空間上重新排列，以最大限度地擴大與納米材料表面的相互作用，從而具有更強的疏水性或親水性[29]。PC可以顯著改變NPs在體內的行為，減少PC形成的主要方法之一是用親水配體和涂層對顆粒進行功能化。親水功能化促進了NPs水化殼的形成，從而使NPs表面與蛋白質和其他生物分子的相互作用減少[30]。Lu等[31]通過熒光強度研究了納米材料(石墨烯和金)的表面親水性是否以及如何影響它們與蛋白質的相互作用；結果表明由于羥基的存在減少了HSA和免疫球蛋白E的吸附，而載脂蛋白E (apolipoprotein E, ApoE)傾向于與所有類型材料發生類似的相互作用。Yu等[32]研究發現隨著NPs疏水性的增加，NPs表面的疏水性相互作用增強，可以結合更多的蛋白質；通過定量分析證明疏水性NPs表面吸附的蛋白質高達親水性NPs的2.1倍；同時蛋白的結合量也與蛋白類型有關，如血紅蛋白胎兒亞基β和血清白蛋白與疏水NPs結合率更高，而體外結合蛋白和抗凝血酶Ⅲ更容易與親水NPs結合，親水性NPs表現出比疏水性NPs更高的HC蛋白交換率。
圖4 不同形狀SiO2NPs吸附PC差異[27]
圖5 四種不同形狀AuNPs及其乳清蛋白冠豐度對比[28]
使用不同的涂層材料，如表面活性劑或聚電解質，可以很容易地調整NPs的表面化學性質。聚電解質涂層由于電荷密度高，可以穩定NPs的分散體。一般來說，聚合物通常對非特異性蛋白質的吸附較少[33]。但Gr?fe等[34]通過特定的蛋白免疫印記檢測，在聚氫丙氨酸涂層的多孔氧化鐵NPs上檢測到白蛋白的吸附量增加，而一些嵌段共聚物穩定的NPs即使親水鏈較短，仍然表現出了突出的蛋白質排斥特性[35]。Weiss等[36]發現在聚合物表面的涂層阻止了參與形成HC的蛋白質在SiO2NPs上的吸附，從而只形成了SC。González等[37]通過在納米材料表面復合羧酸、胺和碳氫化合物的薄膜來評估納米材料表面化學成分對血清和血漿中PC形成的影響；研究發現含有羥基為主的表面化學成分的NPs導致了富含白蛋白的PC的形成，而富含胺的涂層導致精氨酸酶的吸附增加。Abdelkhaliq等[19]發現，在與腸道細胞結合時，PS NPs在用帶負電荷的砜或羧基進行表面修飾后，其表面的蛋白質組成是不同的；結合蛋白、脂蛋白等在顆粒上被富集，而α-2-巨球蛋白、β-2-糖蛋白和血紅蛋白等在砜類功能化PS NPs上的吸收率明顯降低。Kihara等[21]發現天然PS NPs可以與HSA形成HC，而當NPs被羧酸修飾時，只能形成SC。在NPs表面修飾鹽類物質會影響PC中蛋白的含量。Delgado等[38]發現，羧酸鹽會使白蛋白更容易流失，而磺酸鹽對白蛋白的附著力更強，產生持久的HC，具有更好的生物相容性；該機制認為磺酸鹽和胺之間的相互作用能高于羧酸鹽和胺之間的相互作用能。Danner等[39]研究了通過修飾聚甘油(polyglycerin, PG)逐漸增加負電荷的PS，當磷酸鹽含量較低時，聚集素蛋白是最主要的蛋白質；隨著磷酸鹽含量的增加，聚集素蛋白的比例下降到20%左右；此外纖維蛋白原(fibrinogen, Fb)特別是免疫球蛋白成分也同時增加。磷酸鹽的引入不僅使蛋白質的絕對吸附能力大大增加，而且使蛋白質的特異性大大降低。纖維蛋白原和免疫球蛋白隨著磷酸鹽基團的增加而富集。Martens等[40]研究表明，檸檬酸鹽和葡聚糖很容易被Fb取代，纖維蛋白原與表面結合后可以穩定磁性NPs，使其不會隨時間的推移而聚集；PEG涂層通過作為Fb在NPs表面吸附的屏障增加了磁性NPs的穩定性，并使Fb共軛物與含有整合素的膜呈現出更高的結合。
2.1.4 納米粒子的組成成分、濃度與機械性能對蛋白吸附能力的影響
NP的組成成分是決定與NPs結合的蛋白質的親和力和特性的關鍵因素。Deng等[41]研究了人血漿蛋白與具有相同表面電荷金屬氧化物NPs (TiO2、SiO2和ZnO)的結合發現，相似的蛋白質吸附在TiO2NPs和SiO2NPs上，而構成ZnO PC的蛋白質卻截然不同。在TiO2NPs和SiO2NPs的PC中檢測到了簇蛋白、載脂蛋白D和α-2-酸性糖蛋白，而在ZnO的PC中未觀察到這些；而一些其他蛋白質，如轉鐵蛋白、免疫球蛋白重鏈α和結合珠蛋白α僅在ZnO的PC中發現。Monopoli等[42]研究SiO2NPs和PS NPs發現，隨著血漿濃度的增加，PS NPs吸附的蛋白質總量顯著增加，特別是纖維蛋白原和免疫球蛋白的量增加，最初主要與HSA相關，最終與載脂蛋白和補體蛋白一起減少；隨著血漿濃度的增加，雖然SiO2NPs吸附的蛋白質總量略有下降，纖維蛋白原下降約10%，但富含組氨酸的糖蛋白、纖溶酶原、HSA、轉鐵蛋白、硒蛋白和β-糖蛋白等蛋白質被富集。Akhtar等[43]研究了Fe3O4磁性納米粒子(Fe3O4 magnetic nanoparticles, MNPs)和涂有迷迭香酸的Fe3O4磁性納米粒子(Fe3O4@rosmarinic acid, Fe3O4@RA MNPs)對蛋清溶菌酶(egg white lysozyme, EWL)的穩定性和活性的影響；熒光分析結果表明，兩種MNPs都可以對EWL的蛋白質三級結構產生兩種相反的影響，在低于閾值濃度時它們改善了EWL的結構，在高于該濃度時它們逐漸導致其降解；在與兩種MNPs相互作用后，EWL的螺旋度增加，與純RA相互作用后螺旋度下降。如圖6所示，Hui等[44]研究了NPs剛度(700 kPa?10 GPa)對PC形成的影響，結果表明剛度最高的納米膠囊表面PC含有最多的補體蛋白和免疫球蛋白，證實了NPs剛度在控制PC形成方面具有重要作用。
圖6 四種剛度硅納米膠囊對PC形成的影響[44]
綜上所述，NPs的物理化學特性會對PC的形成產生多方面的影響：NPs的尺寸、形狀和機械性能等都會對PC產生不同的影響，需要更多的工作來驗證NPs的物理特性如何影響NPs上吸收的蛋白質的含量、類型和方向。選擇NPs的大小、形狀時還應考慮制備的工藝、時間和成本。NPs不同的形狀會影響它們與蛋白質的結合能力，復雜的結構外觀可能會阻礙NPs與蛋白的相互作用。NPs的化學特性明顯影響吸附蛋白質的類型和含量，且化學特性相較物理特性更容易改變。NPs的表面化學性質對原PC形成的影響是非常復雜的，很難得出一般性的結論。選擇NPs時需注意NPs可能會對生物產生的毒性，盡量選擇毒性較弱、便于代謝的NPs。若需對NPs進行化學改性，應選擇無毒的化學材料防止對生物造成負面影響。同時，不同種類NPs的特性對PC形成也會產生影響，在保持其他因素固定的情況下也應考慮NPs種類對蛋白質吸附能力的影響。設計實驗時還要考慮NPs濃度對PC形成的影響，過高濃度的NPs會發生聚集，而濃度較低則無法比較NPs對蛋白的吸附能力。實驗中可能會涉及以上幾種因素同時影響PC的形成，因此研究這些因素的協同相互作用也將是未來實驗中的重要方向，通過調節NPs的物理化學特性從而達到形成特定PC的目的。
2.2 環境因素對蛋白冠形成的影響
2.2.1 pH對蛋白冠形成的影響水溶液的酸堿度可以影響
蛋白質的結構和蛋白質與NPs間的親和力，從而改變PC的結合位置。Meesaragandla等[45]研究發現HSA作為血漿中最豐富的蛋白質，其構象變化依賴于pH的改變。pH值還會通過氫鍵影響PC的穩定性和PC中蛋白質的折疊[46]。Sanchez-Guzman等[47]發現當pH值為7.0和9.0時，血紅蛋白在NPs表面分別形成HC和SC，從而推斷極性和帶電氨基酸的暴露可能推動了血紅蛋白和NPs之間的相互作用。Huber等[22]研究了pH對蛋白質和NPs之間穩定性的影響。在pH值為3.5和10.0時，沒有測量到明顯的相互作用，而在pH為5.1和6.0時，牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)在NPs表面有強烈的吸附，形成穩定的HC，導致電荷反轉。Givens等[48]研究了模型BSA與兩種不同的金屬氧化物TiO2NPs和SiO2NPs在生理和酸性pH下的相互作用。通過使用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜和熱重分析測定蛋白質結構和蛋白質吸附的pH和NPs依賴性差異。結果如圖7所示，BSA在TiO2NPs和SiO2NPs表面的覆蓋率隨著pH的降低而降低，在酸性pH下，BSA在TiO2NPs上完全展開，而在SiO2NPs上呈現延伸構象。
pH對蛋白質與NPs結合的相互作用力也有很大影響。Wang等[49]研究了固體脂質NPs (solid lipid nanoparticles, SLN)和BSA之間的相互作用，以探索顆粒大小和pH值對BSA PC形成的影響。BSA吸附是由多種力驅動的，pH為7.4時主要相互作用為范德華力和氫鍵，而pH為6.0時為靜電吸引力；此外，由于靜電排斥減弱，PC引起的聚集發生在pH 6.0時，而在pH 7.4中沒有出現聚集的跡象；PC形成后，BSA構象發生變化，包括氨基酸殘基的暴露或隱藏以及α-螺旋含量的增加。NPs可以在一定的pH值范圍內吸收蛋白質，這取決于其等電點。pH值越接近等電點，吸收蛋白質的能力就越強。Shan等[50]檢測了pH 2.0?11.0對TiO2NPs周圍形成的乳清PC的結構和物理化學性質的影響；結果表明溶液的pH值影響乳清蛋白分子的結構，乳清蛋白在等電點的吸附能力最大，在高酸性或堿性條件下吸附能力最低。Davidov等[51]研究了AgNPs的SC中BSA分子在不同pH值下的配合物的締合常數(Kas)和BSA熒光猝滅的雙分子速率常數(Kq)；結果表明pH對Kas和Kq的影響呈現先上升后下降的趨勢，在pH 6.0時最大；結合位點的數量和BSA的SC厚度在pH 6.0時也是最大的，而在較高和較低的pH值下降低。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
圖7 不同pH對TiO2NPs PC和SiO2NPs PC形成的影響[48]
2.2.2 時間和溫度對蛋白冠形成的影響
由于蛋白質在NPs上的吸附和解吸在生理環境中是高度動態的，NPs在顆粒上吸附的原蛋白的質量和數量特征都會隨著孵化時間和溫度發生敏感的變化。Palchetti等[52]研究發現當未改性和聚乙二醇化的脂質NPs暴露于胎牛血清時，孵化時間可以影響PC的組成，從而對細胞攝取產生影響。Li等[53]根據形成機制和時間的變化，研究了蛋白質與PC解離的影響因素；他們發現溫度和半胱氨酸是通過改變蛋白質的結合能力來影響蛋白質的解離程度；結果表明形成一半的Au?S鍵的時間是硫代蛋白解離的重要時間點；當孵化時間超過該時間時，位于HC中的硫代蛋白只能在分析性超離心下通過β-巰基乙醇替換來分離；Au?S鍵形成時間為定義AuNPs的蛋白質富集時間提供了參考。Mahmoudi等[54]發現加熱類型對PC的組成有顯著影響，光誘導加熱與傳統加熱后的PC組成存在顯著差異；在45 ℃條件下，HC中低分子量蛋白質含量更高。Gorshkov等[55]研究了溫度和pH值對AgNPs在人類血漿中形成的PC的影響，結果表明38%的定量蛋白質在所有溫度下都會結合，47%在所有pH值下都會結合；在這些最持久的蛋白質中，大約60%在蛋白質冠層中的豐度沒有明顯變化。而對溫度敏感的蛋白質和對溫度有抵抗力的蛋白質，即使在有限的生理范圍內(從37?41 °C)，溫度也會影響蛋白質擴散率和對NPs的親和力。本團隊研究發現，在超聲條件下SiO2 PC的形成在一定范圍內與時間和溫度呈正相關，而過高的溫度與長時間的超聲則會導致SiO2 PC中蛋白質含量下降，進而影響PC的親水性與抗氧化能力[56]。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
2.2.3 蛋白質濃度、組成和狀態對蛋白冠形成的影響
蛋白質和NPs之間的相互作用受蛋白質的濃度、組成和孵化狀態的影響。蛋白質的各種特性，如分子量、氨基酸組成和表面電荷，都是影響蛋白質與NPs親和力的決定性因素，這影響了PC中多種成分的含量變化[57]。首先，孵化介質中的蛋白質濃度會影響NPs和蛋白質的吸收，導致PC的厚度和穩定性的差異[58]。PC的組成還與血漿或生理液體的種類和來源密切相關。來自患有不同疾病的人類血漿樣本和來自不同來源的血漿，如人類或其他不同動物的血漿，都會影響PC的組成[59]。Solorio-Rodríguez等[60]通過納米液相色譜串聯質譜法進行的蛋白質組學分析確定功能化的SiO2NPs在人和小鼠血漿PC狀圖之間的差異；結果表明在人類PC中發現的最豐富的蛋白質是免疫球蛋白、血清轉鐵蛋白、補體C3蛋白和脂蛋白A-1等；同時，小鼠PC吸附了絲氨酸蛋白酶抑制劑、血清轉鐵蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、纖維蛋白原γ和β鏈等。不同性別的魚的血漿樣品可以使AgNPs的PC在蛋白質多樣性、蛋白質成分的相對比例和特定蛋白質標記物的數量上有明顯的差異[61]；雌性魚血漿中的一些特定蛋白質成分，如卵黃素和透明帶，甚至可以引導AgNPs到特定的器官和組織。
如果NPs暴露在不同的生物液體中，PC的成分也可能會大不相同。在一項研究中，Cui 等[62]評估了裸脂質體、聚乙二醇化脂質體和黏蛋白-1主動靶向聚乙二醇脂質體的PC；一組為在攪拌下與小鼠血清一起孵化以便在體外組裝PC，另一組為直接向小鼠靜脈中注射脂質體并在10 min后恢復血液；在PC組成蛋白質的構象中發現了相關差異，體外PC顯示纖維蛋白含量很高，均勻地覆蓋了表面脂質體；而體內組裝的PC均勻程度和纖維蛋白含量較低；值得注意的是，體內PC的組成更加多樣化，并且比體外條件表現出更多的蛋白質。Barbero等[63]研究了苯酚紅、青霉素-鏈霉素、谷氨酰胺和β-巰基乙醇對細胞培養基中AuNPs PC形成的影響；在這些條件下，蛋白質冠層的形成需要更多的時間，其密度和組成也發生了變化。同時AuNPs的細胞攝取量隨著NP聚集體的形成而增加。孵化過程中在動態或靜態狀態下產生的不同的物理混合效應也會影響PC的形成。PC在接受動態流動產生的剪切應力后可能具有更多的負電荷[64]。與靜態培養相比，人血漿流動產生的剪切應力會在AuNPs上形成更復雜的蛋白層[65]。Bonvin等[66]模擬了體內血液不同流速下(0.03?30.00 cm/s)體外形成的PC組合物，結果表明流速的增加會增加或減少特定蛋白質的數量，且更高的流速的蛋白質具有更大的結構靈活性，而一些蛋白質對NPs的親和力較高，不受流速的影響；在微流體環境中形成的蛋白質冠層的相對蛋白質豐度為30%，而在靜態孵化中生成的蛋白質冠層只有26%；剪切力導致PS NPs會結合更高濃度的血清蛋白，特別是來自胎牛血清的血漿蛋白。 環境因素對PC的影響包括孵化pH、時間、溫度、蛋白質濃度、組成和狀態等。其中pH、時間和溫度主要影響了蛋白質的活性與空間構型，進而影響了蛋白配合物的Kas和Kq。由于pH改變了蛋白質的等電點，它可以極大地影響蛋白質，決定它們的三維結構和整體電荷。pH也會影響NPs表面電荷和功能基團的電離，并最終通過靜電力影響其聚集行為。
蛋白質的濃度、組成和狀態，如搖晃、旋轉或液體的流動，以及在形成環境在生物體內或體外造成的影響，都需要在PC的分析中發現和控制。對于溫度、pH的選擇應考慮不同蛋白質的等電點及變性溫度。此外，對于蛋白質來說，其構象的靈活性也對NPs與蛋白質的相互作用有很大的影響：與剛性蛋白質相比，柔性蛋白質通常具有更大的界面和更好的形狀互補性。這些環境因素不僅影響NPs和生物分子之間的相互作用，而且還會改變NPs本身的特性，如有效電荷、聚集狀態等。以上因素的協同作用尚未被廣泛研究，對于多種因素的復合效應仍需深入發掘。此外大多數關于PC的研究都集中在體外研究，其結果不能完全反映PC的影響。NPs的PC成分和結構都會隨著納米粒子環境的變化而變化。體外研究不能模擬所有的體內參數，也不能提供一個完全真實和動態的實驗環境。對于體外研究，應選擇生物體內含有的蛋白質作為實驗材料，保持模擬的真實性。若使用非生物自身含有的蛋白質，應考慮與其他蛋白質的相互作用以及是否會對生物健康產生影響。不同動物體內的生物環境有所差異，對NPs的研究應在不同生物環境下進行驗證，以探究普遍規律。purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
2.3 分子間作用力對蛋白冠形成的影響
分子間作用也稱為非共價作用，包括疏水作用、靜電作用、范德華力、氫鍵和π?π作用。這些相互作用對于維持蛋白質和核酸等生物大分子的結構、形狀和功能至關重要。這些常見的相互作用力也可以在PC的形成過程中觀察到，這些分子間作用力的類型和強度決定了蛋白質和NPs之間的親和力，從而影響了動力學反應過程。所有這些過程都與熱量的釋放或吸收高度相關[67]。主要的結合力類型仍然可以通過熱力學參數推斷出來：當ΔH>0和ΔS>0時，相互作用的主要驅動力是疏水作用；如果ΔH<0和ΔS<0，主要的力是范德華力和氫鍵；如果ΔH<0和ΔS>0，主要作用力是靜電力[68]。疏水作用被認為是蛋白質折疊的主要驅動力，對保持蛋白質的構象、穩定性和生物活性具有重要意義。蛋白質可能會在NPs表面暴露出疏水殘基，一些相對較大的疏水叔丁基基團可以為NPs提供結合點，并通過疏水作用與之相互作用[69]。靜電相互作用是指生物大分子和NPs等合作方之間的電荷交換引起的吸引或排斥作用。靜電相互作用對PC的影響可以歸結為以下原因。首先是電荷中和效應，這是由蛋白質中帶正負電荷的比例引起的，以調節與帶負電的NPs的相互作用。其次是橋接效應，這種效應產生于反應系統中離子強度的增加，導致蛋白質和NPs之間結合力的增強，從而促進NPs的吸附。最后是特定的受體與配體相互作用，也可能引起強烈的靜電作用。靜電作用比疏水作用稍弱，也是控制蛋白質和NPs結合的主要驅動力[70]。Huang等[71]提出了蛋白質反向電荷奇偶性對位模型，并演示了負電荷表面NPs和正電荷表面EWL之間的靜電相互作用。范德華力和氫鍵在PC的形成過程中都很重要，在闡明NPs和蛋白質之間的相互作用機制時，需要考慮這兩種力的影響。范德華力是蛋白質和NPs之間的分子間力，氫鍵主要發生在NPs的化學基團和蛋白質的極性氨基酸之間[72]。π?π相互作用對PC的影響程度相較其他作用力較小，主要集中在含芳香族氨基酸的PC中。近年來對NPs和PC間分子作用力的研究見表1。
PC的形成和穩定性是由多種分子間相互作用力共同作用而決定的。其中，氫鍵和疏水作用被認為是對PC形成影響較大的分子間相互作用力。氫鍵是一種重要的分子間相互作用力，常見于蛋白質中的氨基酸殘基之間。氫鍵可以促進亞基之間的相互吸引和穩定，進而影響PC的形成和穩定性。疏水相互作用是指非極性分子之間的相互作用力，可以促進蛋白質亞基之間的相互吸引和穩定。疏水作用在PC的形成和穩定性中也發揮了重要作用。雖然靜電相互作用、范德華力和π?π相互作用也對PC的形成和穩定性產生影響，但是相對于氫鍵和疏水相互作用而言，它們的作用相對較小，只有在特殊情況下作為PC形成的主要作用力，如當納米粒子和蛋白質的形狀相互補充時，范德華力通常被認為是形成PC的主要作用力；當蛋白表面局部電荷強度較高時，靜電相互作用更顯著；而π?π相互作用為芳香族蛋白質的結合吸附提供了較強的驅動力。對于不同種類的分子間作用力在NPs與蛋白質形成PC過程所發揮的作用需要進一步研究，針對不同特殊情況下分別設計實驗，并可以通過MD模擬計算進行更高效的驗證。
表1 各種NPs-蛋白質系統中影響PC形成主要分子間作用力
3 蛋白冠的預防措施及利用方法
PC可以增強NPs的生物穩定性和相容性，改變NPs與免疫系統的相互作用，影響NPs的細胞攝取和細胞毒性。但PC也可能干擾靶向配體與組織特異性受體的相互作用，從而影響藥物遞送效率。此外，蛋白冠還可能影響納米材料在體內的分布和代謝。近年來為避免和改善PC帶來的影響，學者們使用特定抗體或配體進行功能化、預先涂覆功能蛋白質、修飾官能團吸引特定蛋白質以及利用特殊蛋白冠來增強納米粒子的遞送效果。為了防止PC的形成，常用的方法是通過接枝親水聚合物(例如PEG)來修飾納米粒子表面，形成水合層，防止蛋白質吸附，這被稱為“隱形”效應[84]。聚合物的密度、分子量和鏈結構影響隱形效應的有效性。除了PEG外，還有其他替代的隱形聚合物，如聚甜菜堿、聚丙烯酰胺接枝瓜爾膠等，它們通過靜電相互作用或其他機制來抵抗蛋白質吸附[85]。天然來源的聚合物，如透明質酸和多糖，也被研究作為潛在的隱形聚合物，可以降低蛋白質吸附，同時可能降低NPs的免疫原性[86]。使用抗體或配體對納米粒子表面進行功能化，可以實現靶向輸送[87]。另一方面，PC的形成可能會影響配體-受體相互作用，因此需要采取措施來減少這種影響，如通過用額外的PEG靶向配體填充PC未占據的納米粒子表面[88]。
白蛋白和載脂蛋白是常用的涂覆功能蛋白質。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質，被廣泛應用于NPs的設計中，旨在提高膠體穩定性、減少非特異性細胞攝取，并延長NPs的循環半衰期。白蛋白可以與其他蛋白質(如糖蛋白或細胞外基質蛋白)相互作用，促進NPs遞送至靶組織。預先涂覆白蛋白是通過將NPs與白蛋白一起孵育，使其物理吸附到NPs表面而實現的。研究發現，使用白蛋白預包被的NPs在黑色素瘤細胞中的細胞攝取方面表現出更好的效果，顯示出比未包被的對照更高的生物利用度、腫瘤分布和抗腫瘤功效[89]。載脂蛋白在NPs設計中的應用主要涉及其促進NPs穿過腦內皮的運輸，如ApoE等載脂蛋白的涂層可增強NPs的腦向性[90]。近年來對于PC的最新研究集中于使對NPs進行表面修飾使其吸引特定蛋白，形成具有特殊功能的PC。Kim等[91]使用多巴胺涂覆介孔SiO2 NPs吸引白蛋白，增強siRNA傳遞以抑制腫瘤生長。Li等[92]設計馬來酰亞胺修飾的PLGA NPs與白蛋白結合，增強血液循環并減弱腫瘤積累。G?ppert等[93]制備出聚山梨酯穩定的NP吸引載脂蛋白結合，并促進它們通過LDLR輸送到大腦。隨后Prabhaka等[94]采用聚山梨醇酯80作為NPs載體的表面改性劑，以改善藥物向大腦的輸送。Chen等[95]在脂質體納米粒(lipid nanoparticle, LNP)表面修飾了正電荷，吸引了玻連蛋白，提高了細胞攝取，尤其是α3陽性細胞。Santi等[96]設計促使轉鐵蛋白結合肽與Au NPs原位結合，增加了轉鐵蛋白受體表達細胞對NP的攝取。Zhang等[97]制備含有聚乙烯亞胺涂層的納米顆粒(RCP NPs)吸引了視黃醇結合蛋白和白蛋白，其中蛋白質結合阻止了NPs的聚集，并導致細胞攝取譜偏向于肝星狀細胞。RCP NPs進入肝臟中的肝星狀細胞，并將下調膠原蛋白的反義寡核苷酸遞送至肝星狀細胞以減少肝纖維化。
通過對納米粒子表面的蛋白進行選擇性設計，可以提高納米粒子向靶向器官的遞送效果。Zhang等[98]使用短肽裝飾的脂質體捕獲血漿中的載脂蛋白A1、載脂蛋白E和載脂蛋白J，實現對腦腫瘤的短干擾RNA遞送，并在外泌體模擬物表面修飾二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-多肽，通過與脂蛋白受體相關蛋白1的相互作用促進血腦屏障轉運，將多西紫杉醇遞送至膠質母細胞瘤。通過控制表面成分，如陽離子脂質體和DNA復合物的DNA涂層，可以改善NPs的PC輪廓，提高對腫瘤的遞送效果[99-100]。對納米晶體使用表面穩定劑，則會影響藥物的藥代動力學和生物分布曲線和抗腫瘤作用[101]。表面成分的不同結構導致PC特征的變化，影響LNP在體內的器官向性，Zhao等[102]研究發現咪唑基類脂質的LNP傾向于靶向脾臟，而尾部帶有酯鍵的LNP則主要沉積在肺部。Shen等[103]研究發現葡聚糖包被的亞鐵NPs可以通過激活凝集素補體途徑靶向脾臟中的B細胞。Astarita等[104]將陽離子脂質復合物利用人造PC預功能化，改善角膜上皮細胞的攝取，提高在眼球內的遞送效果。
在許多情況下，不受控制的PC會干擾納米粒子NPs的預期功能，導致NPs在體內積累、免疫反應受損以及靶向特異性相互作用的喪失。與此同時，血液中存在一些特定的蛋白質，如白蛋白、轉鐵蛋白和載脂蛋白，它們能夠增強NPs向特定器官的輸送。因此，可以合理地設想使用所需的蛋白對NPs進行預功能化，或通過工程設計表面以優先在原位選擇這些蛋白質進行結合。
針對PC的研究應用仍然面臨許多挑戰。首先，由于醫療條件和疾病的不同，特定蛋白質的含量存在很大差異。其次，蛋白質的變異性可能會破壞基于人群的研究確定的PC效用。第三，對非蛋白質生物分子在納米粒子性能中的作用了解有限。因此，未來的研究需要深入了解非蛋白質冠的功能以及其成分之間的相互作用。可以結合計算機輔助預測PC與NPs的相互作用，并根據每個患者的情況定制NPs的設計。最后，雖然PC分析已成為NPs表征的常見做法，但大多數研究依賴于動物源血清中NPs的體外培養。目前的方法在許多方面都存在局限性。血液蛋白質成分因物種而異，因此通過動物血清獲得的信息可能無法推廣到人類。體外研究通常在靜態條件下進行，無法考慮可能影響PC與NPs相互作用的血流剪切應力。此外，PC的分析主要集中在HC的研究，而沒有反映在循環中不斷重塑的SC的功能。因此，為了準確預測PC與NPs相互作用以及進行相應的納米粒子設計，需要發展能夠反映體內動態條件的穩健體外方法。 purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
4 展望
PC已成為反映NPs行為的標簽，由于NPs在人體內形成PC會產生潛在的風險和不確定的影響，近年來對PC的研究備受關注。PC對NPs的影響體現在諸多領域：例如生物成像、生物傳感、藥物輸送、診斷和治療等生物醫學領域，生物傳感器、肥料和生長促進劑等農業領域，以及營養載體、食品添加劑和功能性食品等食品領域。因此，了解PC的形成機制和影響因素對理解和預測其體外和活體反應至關重要。本文回顧了近年來對PC形成機制及影響因素的研究進展，主要介紹了NPs特性、環境因素以及分子間作用力三方面的影響，同時對PC的預防和利用進行了總結。了解蛋白冠的形成機制和影響因素會幫助我們理解蛋白冠的形成過程并針對特定需求來控制特定蛋白冠的形成。雖然在PC的表征方面已經取得了重大進展，但影響PC結構的時間、環境變化以及蛋白質的競爭性吸附/解吸所帶來的影響仍需進行大量的研究。鑒于PC的復雜性，需要更詳細地研究以下方面。首先，要跟蹤PC成分在運輸過程中的動態變化，研究蛋白質在NPs上的結構、特性和停留時間。其次，NPs表面PC所形成的生物界面可能會在細胞、組織、器官的層面上引發特殊反應，需要了解PC如何誘導細胞免疫反應，并針對不同需求制定不同功能的NPs。最后，應加強對PC差異的研究，解決不同物種、患有不同疾病人群的血液環境改變以及蛋白質變異性導致的PC變化，發展能夠反映體內動態條件的穩健體外方法。根據進入人體后產生的不同生物、化學反應選擇適合的NPs。對PC的認識仍處于起步階段，對PC的生物效應的研究僅局限于個體，很少有總體的客觀規律。現在迫切需要了解PC對生理系統的影響，以減輕潛在的危害。未來，我們可以通過一系列的實驗和模擬研究，進一步探究蛋白冠形成機制和影響因素。例如利用高分辨率的成像技術來觀察蛋白冠結構的細節，并進一步研究其組裝動力學和三維結構。此外，還可以基于計算機模擬和機器學習技術，來預測蛋白質突變對PC結構的影響。
purimag 系列可作為研究該過程的重要工具（PuriMag蛋白冠前處理磁珠試劑盒|高深度蛋白質組學-生物磁珠專家）。
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