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產(chǎn)品名稱
包裝
PMG-TagAb003-1mL
PuriMag? Anti-Flag Magnetic Beads （Anti-Flag磁珠）
1mL×1
PMG-TagAb003-5mL
1mL×5
保存條件： 4oC保存，至少三個月有效。長期不使用，可以-20oC保存，-20oC可以保存更長時間。
一．產(chǎn)品簡介
2 PuriMag? Anti-Flag Magnetic Beads，即Anti-Flag磁珠，也稱Anti-Flag免疫磁珠或Flag抗體磁珠，是由高品質(zhì)的Flag小鼠單克隆抗體與納米級磁珠共價偶聯(lián)而成，可特異性地與動植物或微生物裂解液、血清、腹水等中含有Flag標(biāo)簽的蛋白結(jié)合，從而用于帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白或其蛋白復(fù)合物的免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（Co-IP）或純化。
2 Flag標(biāo)簽（Flag-tag）、Myc標(biāo)簽（Myc-tag）、HA標(biāo)簽（HA-tag）、His標(biāo)簽（His-tag）和GST標(biāo)簽（GST-tag）等是表達載體上最常見的一些標(biāo)簽，通過與這些標(biāo)簽的融合表達可以非常方便地檢測目的蛋白及與目的蛋白相互結(jié)合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的純化。
2 Flag-tag是8個氨基酸殘基（DYKDDDDK）組成的多肽，常用的形式有Flag和3×Flag，通過基因重組技術(shù)把Flag-tag的核酸序列與目的基因的5’端或3’端連接，就可最終表達形成Flag-tag的目的蛋白。Flag-tag具有以下優(yōu)點：Flag-tag通常不會與目的蛋白相互作用，并且大多數(shù)情況下不會影響目的蛋白的功能；Flag-tag作為標(biāo)簽蛋白，后續(xù)通過Flag抗體、Anti-Flag磁珠或Anti-Flag親和凝膠即可對目的基因的表達、定位及功能進行檢測或?qū)δ康牡鞍走M行純化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag標(biāo)簽，可被腸激酶（Enterokinase, EK）切除（DDDK），從而得到完美的沒有標(biāo)簽的目的蛋白。基于以上優(yōu)點，F(xiàn)lag標(biāo)簽已被廣泛應(yīng)用于蛋白表達、純化、鑒定、相互作用和功能等多方面的研究。
2 PuriMag? Anti-Flag Magnetic Beads，也被稱為Anti-DYKDDDDK Magnetic Beads，可以特異性地結(jié)合Flag標(biāo)簽融合蛋白，并可以借助磁力架非常便捷地應(yīng)用于帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白或其蛋白復(fù)合物的免疫沉淀或純化等實驗。
2 本產(chǎn)品特異性強、靶蛋白結(jié)合量高。與國內(nèi)外大多數(shù)的同類產(chǎn)品相比，本產(chǎn)品抗體結(jié)合密度高，對帶有Flag標(biāo)簽蛋白的結(jié)合具有很強的特異性，并且本產(chǎn)品磁珠粒徑小，不易產(chǎn)生非特異吸附。本產(chǎn)品懸液含約10mg磁珠/mL，含有不少于0.6mg Flag抗體，通常可結(jié)合不少于0.6mg Flag標(biāo)簽融合蛋白，具體的最大結(jié)合量和標(biāo)簽蛋白的分子量大小等相關(guān)。每500微升樣品，通常僅需使用10-20 μL磁珠懸液，就可高效地進行免疫沉淀實驗。
2 本產(chǎn)品可結(jié)合多種形式的Flag標(biāo)簽蛋白。本產(chǎn)品可特異性地結(jié)合甲硫氨酸修飾的N端Flag融合蛋白（Met-Flag-Protein）、N端Flag融合蛋白（Flag-Protein）、C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）。
2 本產(chǎn)品結(jié)合目的蛋白速度快。本產(chǎn)品使用了~200nm納米級磁珠，具有超大的比表面積，便于抗體和抗原的快速有效結(jié)合。通常10 min內(nèi)即可完成抗原吸附的過程，30 min內(nèi)完成目的蛋白免疫沉淀操作。縮短操作時間可以有效避免在長時間操作過程中目的蛋白的降解或變性，充分保證目的蛋白的活性。
2 本產(chǎn)品可選擇多種洗脫方法。本產(chǎn)品可以根據(jù)目的蛋白的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及后續(xù)應(yīng)用的要求等，使用多種洗脫方法，包括Flag多肽、酸性和SDS-PAGE上樣緩沖液等洗脫液進行洗脫。特別是Flag多肽洗脫后不會包含抗體的輕鏈和重鏈，可以有效解決免疫沉淀后Western實驗中輕鏈和重鏈的干擾問題。本產(chǎn)品用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果參考圖1。
二．主要技術(shù)指標(biāo)
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled antibody
Anti-Flag mouse monoclonal antibody
Isotype
IgG2b
M.W. of antibody
Approximately 150kDa
Antibody concentration
≥ 0.6mg Flag antibody per ml beads
Binding capacity
≥ 0.6mg Flag‐tagged fusion protein per ml beads
Specificity
Met-Flag-Protein, Flag-Protein, Protein-Flag
Elution method
Acid, peptide competitive or SDS‐PAGE loading buffer elution. Note: If elute with SDS-PAGE loading buffer, the light (~25kDa) and heavy (~50kDa) chain of Flag antibody will be denatured and release from the beads.
Application
IP, Co-IP, Protein purification
三．注意事項
l 本產(chǎn)品經(jīng)測試，反復(fù)凍融3次以上，不影響使用效果。
l 本產(chǎn)品需維持pH為6-8，避免高速離心和干燥；請勿長時間置磁珠于磁場中，否則可能會引起磁珠聚團。
l 本產(chǎn)品使用前要適當(dāng)充分重懸，混勻操作須輕柔，不宜劇烈渦旋震蕩等，避免抗體變性等。
l 在免疫沉淀或純化時，建議設(shè)置陽性和陰性對照組。
l 蛋白樣品收集后宜盡快完成純化工作，并應(yīng)始終放置在4oC或冰浴，以減緩蛋白降解或變性。為有效抑制蛋白降解，可以在蛋白樣品中添加適量的蛋白酶抑制劑混合物。
l 如果使用真空泵等儀器吸取上清液，須注意真空泵的吸液強度，以免吸力過大而吸取到聚集的磁珠。
l 酸性溶液洗脫時磁珠可能會發(fā)生聚集，屬于正常現(xiàn)象，不影響磁珠的正常使用。0.1%的非離子型去垢劑（如Triton X-100、Tween-20或NP-40）可有效防止磁珠聚集，并且不會影響磁珠的抗體結(jié)合效率。
l 高濃度的DTT、巰基乙醇、鹽酸胍等對本產(chǎn)品與標(biāo)簽蛋白的結(jié)合可能有一定影響，但Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液或NP-40裂解液等都完全適用。
l 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員科研使用。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
四．使用說明
1. 樣品的制備
a. 選擇合適的裂解液，用于制備細(xì)胞或組織的裂解液。如果使用自行配制的或其它公司生產(chǎn)的裂解液，需要確保裂解液的pH為6-8。
b. 具體的細(xì)胞或組織樣品裂解的制備步驟請參考裂解液的使用說明。制備好的裂解液上清宜置于冰上或4oC存放，隨后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、標(biāo)簽蛋白的純化等操作。新鮮制備好的樣品，建議盡量當(dāng)天完成免疫沉淀等后續(xù)操作，但如果樣品不能當(dāng)天使用，也可以適當(dāng)分裝后-80oC凍存。
2. Anti-Flag磁珠的準(zhǔn)備
由于Anti-Flag磁珠儲存在特殊保護液中，所以需要在加入樣品前適當(dāng)洗滌。
a. 用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠，按照每500μl樣品10μl或20μl磁珠懸濁液，取適量Anti-Flag磁珠至一潔凈離心管中，加入1×TBS至最終體積為約0.5ml。
b. 用移液器輕輕吹打并充分重懸Anti-Flag磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)上述步驟兩次。
c. 按照初始體積的量，用1×TBS重懸Anti-Flag磁珠。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
a. 加入磁珠與孵育。按照每500μl蛋白樣品加入10μl或20μl磁珠懸濁液的比例加入Anti-Flag磁珠，置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育2小時或4oC孵育過夜。注：孵育過程中，如果磁珠發(fā)生聚團或呈片狀屬正常現(xiàn)象，不會影響實驗結(jié)果。
b. 磁分離。孵育完畢后，磁分離，去除上清。注：可保留部分上清液，用于檢測免疫沉淀的效果。
c. 洗滌。加入500μl的1×TBS，用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠。磁分離，去除上清。重復(fù)洗滌三次。注：也可以通過檢測洗滌得到的洗滌液的OD280來判斷是否洗滌完全，若OD280大于0.05，應(yīng)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。
4. 洗脫
根據(jù)標(biāo)簽蛋白的特點及后續(xù)實驗要求，可以選擇如下3種方法之一進行洗脫。
a. 3×Flag競爭洗脫法：本方法為非變性法，洗脫效率高，且洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測。
(a) 3×Flag多肽洗脫液的配制：取適量3×Flag多肽溶解于1×TBS中，使其終濃度為150μg/ml，或稀釋5mg/ml的3×Flag多肽溶液至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl 3×Flag多肽洗脫液（150μg/ml），混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫?fù)u晃孵育30-60分鐘，或4oC孵育1-2小時。為了提高洗脫效率，可延長孵育時間或重復(fù)洗脫。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。上清即為洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白。
(d) 洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白置于4oC待用，或者-20oC或-80oC長期保存。
b. 酸性洗脫法：本法為非變性法，比較快速且高效。洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測。
(a) 溶液的配制：酸性洗脫液（0.1M Glycine-HCl, pH3.0），中和液（0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl）。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl酸性洗脫液，混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育5分鐘。注：孵育時間不宜超過15分鐘。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并立刻加入10μl中和液，適當(dāng)混勻。
(d) 為了獲得最大的洗脫效率，可重復(fù)步驟b和c，并將相同樣品合并。
(e) 洗脫并中和的Flag標(biāo)簽蛋白置于4oC待用，或者-20oC或-80oC長期保存。
注1：酸性洗脫法雖然高效，但仍可能低于競爭洗脫法或SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法。
注2：由于目的蛋白的差異可能對酸性洗脫法的洗脫效率有一定的影響，如果對洗脫效率的要求比較高，可對酸性洗脫液的pH在2.5-3.1之間進行一定的調(diào)整，相應(yīng)的中和液的pH值或量也要進行一定的調(diào)整，例如100μl酸性洗脫液（0.1M Glycine-HCl, pH2.8）和15μl中和液（1M Tris-HCl, pH8.5）。
c. SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法：本方法為變性法，得到的蛋白樣品適合SDS-PAGE電泳或WB檢測。
(a) SDS-PAGE上樣緩沖液的配制：參考《分子克隆》等配制5×或2×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，然后加入水配制成1×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。通常SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液含有DTT等還原劑，其洗脫得到的蛋白樣品中會含有Flag抗體的輕鏈和重鏈。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積的磁珠，加入100μl 1× SDS-PAGE上樣緩沖液，95oC加熱5分鐘。
(c) 置于磁力架上分離10秒，取上清進行SDS-PAGE電泳或Western檢測。
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