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規(guī)格
MS-TRP001
1 ml
MS-TRP010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
固定化胰蛋白酶MagStart-Trypsin是一種磁性聚合物微粒上的Trypsin。MagStart-Trypsin技術(shù)有別于傳統(tǒng)的固體或裂解珠技術(shù)，因?yàn)樗峁┝艘粋€(gè)超多孔聚合物網(wǎng)絡(luò)，允許蛋白質(zhì)滲透到整個(gè)微顆粒的體積中。這樣就能多點(diǎn)共價(jià)連接Trypsin等蛋白質(zhì)的多點(diǎn)共價(jià)附著，穩(wěn)定酶在非標(biāo)準(zhǔn)條件下的應(yīng)用，并防止自溶。MagStart-Trypsin可替代MagReSyn? Trypsin實(shí)現(xiàn)快速有效的蛋白質(zhì)消解。
固定化胰蛋白酶MagStart-Trypsin設(shè)計(jì)目的是提高質(zhì)譜分析產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。磁性微粒允許在磁處理平臺(tái)實(shí)現(xiàn)樣品消化自動(dòng)化，從而提高通量和實(shí)驗(yàn)一致性。固定化蛋白水解酶的主要特點(diǎn)是可以增加樣品覆蓋深度，因?yàn)槊缚稍?MS 分析前去除。 固定化提高了酶在非標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性，如有機(jī)溶劑和離液鹽的存在，從而提高蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程的通用性。磁微粒的胰蛋白酶含量高，可縮短方案時(shí)間。消化時(shí)間僅為 1 小時(shí)，達(dá)到通常只有 24 小時(shí)胰蛋白酶消化才能達(dá)到的數(shù)據(jù)質(zhì)量。此外，微顆粒的可壓縮性還減少了洗滌和洗脫過(guò)程中微顆粒之間的間隙，從而提高了這些步驟的效率。使用磁分離器，MagStart-Trypsin可快速分離（<20 秒）。競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的微粒則需要長(zhǎng)達(dá) 4 分鐘的時(shí)間才能分離。
MagStart-Trypsin優(yōu)勢(shì)
益處
高Trypsin載量
高效消解 <60 min；
增加難消解蛋白消解效率；
降低反應(yīng)體系體積；
在變性劑存在下消解
增加難消解蛋白的消解效率；
減少Trypsin的自消解
移除消解酶提高數(shù)據(jù)質(zhì)量；
快速磁分離
方便高效移除Trypsin；
高通量；自動(dòng)化；
抗氧化
減少樣品污染物；
延長(zhǎng)貨架期。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Protein digestion, proteomics, mass spectrometry, sample preparation
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functionality
Trypsin
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
15 mg/ml in 100 mM acetic acid
Stability
pH 8.0, 37 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當(dāng)儲(chǔ)存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 樣品準(zhǔn)備、MagStart-Trypsin的平衡和消化
有幾個(gè)因素會(huì)影響胰蛋白酶消化的效率。這些因素包括樣品制備、緩沖液成分和 pH 值、污染物或干擾化合物的存在以及消化溫度。MagStart-Trypsin可提高覆蓋率，改善難消化蛋白質(zhì)的裂解。如沒(méi)達(dá)到最佳性能，請(qǐng)參閱下面的推薦樣品制備/平衡/消化程序以及《常見(jiàn)問(wèn)題》（第 3 節(jié)）。
注意：所有試劑均應(yīng)新配并達(dá)分析級(jí)，以確保最佳性能。下文所述緩沖液僅作示例，并不具限制性。
2.1. 樣品制備
為確保最佳消化，目標(biāo)蛋白需變性、還原和乙酰化。
1) 將樣品懸浮在含6–8 M 尿素的Tris緩沖液中（50 mM，pH 8.0）。
2) 加二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度為10 mM。
3) 室溫孵育 1 h。
4) 加入碘乙酰胺（IAA）至終濃度為 30 mM。
5) 黑暗環(huán)境下孵育45 min。
6) 用Tris緩沖液（50 mM，pH 8.0）稀釋或透析樣品至尿素濃度 ≤1 M。
注意：固定化酶具有防止變性的穩(wěn)定性，酶可能適合在非標(biāo)準(zhǔn)條件下使用，如增加離液鹽的濃度（盡管活性會(huì)降低）。
2.2. MagStart-Trypsin的平衡
MagStart-Trypsin以15 mg/ml的懸浮在 100 mM 乙酸中。運(yùn)輸時(shí) 磁微粒在消化緩沖液（50 mM Tris，pH 8.0）中平衡。按以下步驟平衡足夠數(shù)量的微粒以進(jìn)行消化反應(yīng) 如下所述：
1) 渦旋或倒轉(zhuǎn)重懸 MagStart-Trypsin胰蛋白酶，以確保懸浮液均勻。
2) 將 20 μl的MagStart-Trypsin轉(zhuǎn)移到一新試管中（20 μl的MagStart-Trypsin足以在60min內(nèi)pH 8.0 的 50 mM Tris 溶液中消化 ~50 μg 總蛋白）。
注意：（1）起始蛋白量少于50 μg時(shí)，微粒的數(shù)量可減少到最少 5 μl，保持微粒與蛋白的比例。（2）在變性條件下（即 2-6M 尿素或高達(dá) 0.5% SDS）消化時(shí)，將微粒量至少增加到 60μl，消化時(shí)間至少增加到37°C下2 h。
3) 磁分離至澄清。
4) 吸除上清液。
5) 用移液管輕輕將MagStart-Trypsin再懸浮于 50 μl 的 Tris（50 mM, pH 8.0）中。
6) 將試管放在磁性分離器上，回收磁微粒。
7) 吸除上清液。
8） 重復(fù)步驟5~7。
9） 吸除上清液后，MagStart-Trypsin。
2.3. 蛋白消化流程
1) 將在消化緩沖液（50 mM Tris，pH 8.0）中預(yù)平衡過(guò)的蛋白質(zhì)樣品加入2.2的MagStart-Trypsin。
2) 使用 50 mM Tris 將總反應(yīng)體積調(diào)至 50 μl。
3) 在 37°C 下用渦旋或合適的微離心管混勻器將樣品孵育 60 min，以確保MagStart-Trypsin在消化過(guò)程中保持懸浮狀態(tài)。由于樣品量較少，不建議倒置混合。
4) 如上所述，磁回收微粒。
5) 將上清液（消化肽）轉(zhuǎn)移到新離心管中。
6) 向微顆粒中加入50 μl 的5 M NH4OH。
7) 在室溫條件下，用渦旋或合適的微離心管混勻器將樣品孵育20 min，洗脫過(guò)程中保持懸浮狀態(tài)。由于樣品量較少，不建議倒置混合。
8) 將離心管放在磁分離器上至澄清。
9) 將上清液（洗脫肽）轉(zhuǎn)移到裝有剩余消化肽的微離心管中（步驟 2.3.5）。
10) 向匯集的多肽中加入甲酸，至最終濃度為 0.5%。
注意：在使用低量起始蛋白質(zhì)（少于 20 μg）時(shí)，建議通過(guò)凍干或真空干燥減少 體積。
11) 使用 C18 柱子或其它合適方法對(duì)樣品脫鹽。
12) 進(jìn)行質(zhì)譜分析。
注意：如果蛋白質(zhì)數(shù)量允許，可使用 SDS-PAGE 評(píng)估蛋白質(zhì)消化的效率。
3. 常見(jiàn)問(wèn)題
問(wèn)題
可能原因
改善方法
不完全消化
消化pH不對(duì)
確保消解pH=8.0
消解溫度
確保消解溫度為37 °C
目標(biāo)蛋白的消解位點(diǎn)不可及
在更高溫度（如55 °C）消解或重新評(píng)估高離液鹽消解條件（如 2-5 M尿素）
初始蛋白中含干擾物
在推薦消解緩沖液中稀釋或透析除去污染物
初始蛋白量不對(duì)
采用其它蛋白定量方法
消化時(shí)間不足
增加消解時(shí)間至4-6 h
低的序列覆蓋率或低的質(zhì)譜信號(hào)
最終洗脫肽中含干擾化合物
將洗脫下來(lái)的肽段進(jìn)行脫鹽
蛋白/微粒比例不合適
維持30μl 磁顆粒對(duì)50μg蛋白，方案可調(diào)整至最小5μl 磁顆粒對(duì)~10μg蛋白
本磁珠僅供科研使用！
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