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規格
MS-ZRM001
1 ml
MS-ZRM010
10 ml
1. 產品描述
MagStart-IMAC-Zr（使用鈦離子作為固定化金屬親和層析）是一種專有的磁性聚合物微球載體，提供簡單、方便、高效的磷酸肽富集方法，例如胰蛋白酶消化的蛋白質混合物。該產品利用聚合物技術的卓越特性，將鈦離子（Ti4+）螯合到聚合物微球MagStart上，設計了一種高度特異性富集磷酸肽的產品，適用于基于質譜的蛋白質組學應用。與MagReSyn?-Zr-IMAC有等同效果。
MagStart-IMAC-Zr微粒極高的官能團密度為生物分子偶聯提供了高濃度的反應位點。MagStart-IMAC-Zr的高結合載量允許減少高活性功能微粒的體積來實現實驗方案小型化，進而最大限度地減少所需試劑的體積，從而允許以更小的體積應用固定化配體。MagStart可快速磁分離（<10 秒），通過磁壓縮減少了洗滌和洗脫過程中顆粒間隙，從而提高了效率和回收率，強磁性還可防止微粒的意外丟棄而避免樣品損失。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Isolation and purification of phosphopeptides
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Zr4+
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
20 mg/ml suspension in 20% ethanol
Stability
pH 2.5~12, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label DO NOT FREEZE
注意：不當儲存、微粒干燥、細菌污染或離心回收可能導致容量/性能的不可逆損失。使用前應充分混勻。
2. 結合和洗脫流程
可能影響磷酸肽結合的因素包括緩沖液組成和pH值，以及DNA或其他干擾化合物等污染物的存在。超聲處理可能不足以降解 DNA，建議在裂解物中降解 DNA（e.g. Benzonase?）。我們建議在富集前對樣品進行脫鹽，以去除干擾化合物，例如使用Waters Sep-Pak C18或Oasis HLB濾芯。所需的磁珠數量可能需要根據您的應用進行優化，主要是多肽：磁珠比例，以確保最佳回收率和特異性。
注意：所有試劑都應是新鮮制備的分析級，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法和緩沖溶液僅供參考，無意限制。MagStart-IMAC-Zr 與一系列不同的磷酸肽富集緩沖液兼容。可實現的純度和產量取決于實驗條件，應針對每個特定應用進行優化。
2.1. MagStart-IMAC-Zr的平衡
MagStart-IMAC-Zr 以 20 mg/ml懸浮于20% 乙醇中形式提供，使用前需要去除運輸溶液，并在結合緩沖液中平衡微粒。每個反應需要至少20μl磁珠懸浮液以確保手動吸取和自動化方案中的磁珠沉淀的量。目前的方案足以從~500μg總蛋白消化物中純化磷酸肽。可通過對當前協議進行以下調整來適應起始蛋白：
Protein Digest
Bead Quantity
Ratio of Beads/Peptide
Equilibration volume (μl)
Wash volume (μl)
20 μg
20μl: 0.4mg
20
200
100
50 μg
8
100 μg
4
200 μg
40μl: 0.8mg
500 μg
100μl: 2mg
1 mg
200μl: 4mg
2 mg
400μl: 8mg
400
注意：雖然這是推薦的方案，但富集可能取決于樣品。例如：對于磷酸肽豐度低的樣品，您可以降低微珠與蛋白質的比率（即，將 1 mg 微珠用于 500 μg 蛋白質，蛋白質：微珠比例為 1：2）。理想的比率應該是基于樣品經驗性的。
1） 通過渦旋混合或倒置徹底重懸 MagStart-IMAC-Zr，以確保磁珠均勻的懸浮。
2） 將100 μl 的MagStart-IMAC-Zr（2 mg 珠子，蛋白與珠子比例為1：4）轉移到2 ml離心管中。
3） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清。
4） 移除上清運輸保存液。
5） 加入200 μl Loading Buffer （0.1 M glycolic acid in 80% ACN, 5%TFA），平衡60秒。
注意：調節glycolic acid濃度對富集結合容量、特異性和選擇性（如單磷酸化多肽和多磷酸化多肽）有影響。在進行大規模富集效率研究前，建議根據樣本來源和純度評估glycolic acid濃度范圍，以獲得最優結果。
6） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除Loading Buffer。
7） 重復步驟5和6兩次，共進行三次平衡。
8） 移除Loading Buffer后，MagStart-IMAC-Zr可直接用于目標磷酸肽的結合。
2.2. 磷酸化多肽富集流程
1） 將500 μg脫鹽蛋白在200 μl Loading buffer中酶解和混勻。
2） 4℃下10000×g離心5分鐘移除不溶物。
3） 將上清液轉移到2.1步驟準備好的MagStart-IMAC-Zr磁珠中。
4） 渦旋或移液槍上下吹打混勻磁珠。
5） 在室溫孵育20分鐘確保磁珠樣本充分互作。
6） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
7） 加入100 μl的Loading buffer輕輕攪動2分鐘，以洗去未結合的的樣本。
8） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
9） 加入100 μl的Wash buffer 1 （80% ACN和1% TFA水溶液）輕微吹打2分鐘，重選洗去非特異性結合的多肽。
10） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清，并移除上清液。
11） 加入100 μl Wash buffer 2 （10% ACN和0.2% TFA水溶液）再輕微吹打2分鐘洗滌磁珠。
12） 加入150 μl Elution buffer（1% NH4OH）持續輕微混勻10分鐘，洗脫磁珠結合的磷酸多肽。
13） 將離心管置于磁力架上10秒至磁分離澄清。
14） 將含磷酸多肽的洗脫上清液轉移到低蛋白吸附的離心管中（含50μl的10% Formic Acid）。
15） 重復12-14步驟以提高回收率。
16） 將所有洗脫液合并成得400 μl。
17） 凍干或真空干燥洗脫液（-80℃處理30分鐘）。
18） 質譜分析樣品。分析前可通過C18 SPE柱除鹽或在線C18除鹽濃縮后進行液質分析。
2.3. 推薦緩沖液
Loading buffer: 0.1 M glycolic acid in 80% acetonitrile (ACN), 5% trifluoroacetic acid (TFA)
Wash buffer 1: 80% ACN, 1% TFA
Wash buffer 2: 10% ACN, 0.2% TFA
Elution buffer: 1% NH4OH
3. 常見問題
問題
可能原因
改善方法
配體未按預期與微粒結合
反應時間不夠
延長孵育時間到30分鐘
樣品或溶液中的干擾物阻止結合
DNAse酶和脫鹽處理以移除潛在的干擾物
微粒數量不足
增加顆粒的數量
非特異性結合多肽
磷酸化多肽結合競爭不足
增加結合液中glycolic acid濃度或降低磁珠/蛋白比例
洗滌體積不夠
增加洗滌液體積到高至500μl
洗滌時間不夠
增加洗滌時間
嘗試替換洗滌液
Wash buffer 1: 60% ACN, 1% TFA, 200mM NaCl；
Wash buffer 2: 60% ACN, 1% TFA
低磷酸化多肽回收
嘗試替換洗脫液
確認NH4OH濃度為1%。增加到4%，并加入CAN至終濃度為40%。
對樣本重新使用磁珠
將2.2中步驟6的上清保留并重新與磁珠孵育。
濃縮倍數不夠
質譜前凍干濃縮樣品。
低于預期質譜信號
脫鹽。降低洗脫時間。
TMT標簽應用中低回收
與樣本或試劑不相容
請參考產品引用
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