1. 概述
PuriMagTM G-Ts磁性納米微粒是均一的、聚合物包覆的超順磁納米粒，親水表面確保磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性、低非特異吸附和易操作性，表面涂有高密度甲苯磺酰基活性基團，可以在不使用偶聯劑的情況下，共價固定包含-NH2或-SH基團的配體進行生物分離。由于疏水的甲苯磺酰基通過偶聯反應而被消除，因此珠的表面變為親水性的。這種化學方法使配體能夠保持其高活性功能，并在細胞和細菌破碎液中獲得高收率和低的非特異性結合生物分離，這是快速免疫測定中的固相，用于分子應用或噬菌體展示文庫的篩選。對特定靶蛋白（例如標記、受體、酶）具有親和力的配體蛋白也可以與PuriMagTM G-Ts磁珠進行表面偶聯。
特點與優勢
w 預先激活并可以使用；
w 推薦的偶聯條件：在37°C時pH 7.5~9.5高效；
w 偶聯后表面沒有電荷；
w 穩定的共價鍵，配體泄漏最少；
w 低非特異性結合；
w 1~20 mg蛋白質或0.1~2mg肽/ g磁珠
w 應用：細胞分選，免疫沉淀，抗體純化，蛋白質/肽，DNA / RNA；
PuriMagTM G-Ts磁珠偶聯機理：
2. 產品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Tosyl group
Group density
~300 μmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in 1mM HCl
Stability
pH 3.5~10, 4~80 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：
1）配體必須不含競爭性配體，例如蛋白質、糖或穩定劑。
2）添加硫酸銨（緩沖液C）至終濃度1.0–1.5 M將增加與磁珠偶聯的抗體量。
3）在37°C下12~18小時后，配體與磁珠的最大共價結合。 20°C偶聯需要更長的孵育時間（> 20小時）才能達到相同程度的化學結合。在4°C下，化學結合非常緩慢（> 48小時）。建議在低溫下使用緩沖液A。
A. 所需材料
1）緩沖液A，B和C用于預清洗和偶聯PuriMagTM G-Ts磁珠。pH穩定的配體，建議使用緩沖液A進行耦合。對于pH不穩定的配體，請使用緩沖液B。
2）請勿向這些緩沖液中添加任何蛋白質（除了特定的蛋白質配體之外）、糖等。
3）緩沖液D和E用于洗滌所有配體偶聯的磁珠。緩沖液E也可用于儲存配體偶聯的磁珠。請勿使用任何含有蛋白質或氨基的緩沖液（例如甘氨酸、Tris）進行預洗或偶聯至這些磁珠。如果BSA干擾您的下游應用，請用另一種蛋白質（例如HSA）或表面活性劑（例如Tween 20）代替它。建議使用蛋白質阻斷劑，因為它可以減少聚集和非特異性結合。
3）如果偶聯的磁珠需要防腐劑，可以將最終濃度<0.1％（w / v）的NaN3添加到緩沖液E中。
注意：疊氮化鈉可能與鉛和銅管反應生成高度爆炸性的金屬疊氮化物。
4）緩沖液
Buffer A (0.1 M borate buffer pH 9.5): 6.18 g H3BO3 (MW 61.83). Dissolve in 800 mL distilled water. Adjust pH to9.5 using 5M NaOH and adjust volume to 1 L with distilled water.
Buffer B (0.1 M Na-phosphate buffer, pH 7.4): 2.62 g NaH2PO4 × H2O (MW 137.99) and 14.42 g Na2HPO4 × 2 H2O (MW177.99). Adjust volume to 1 L with distilled water.
Buffer C (3 M ammonium sulphate in Buffer A or B): 39.64 g (NH4)2SO4 dissolved in Buffer A or B. Adjust pH with NaOH or HCl. Adjust up to 100 mL with Buffer A or B.
Buffer D (PBS pH 7.4 with 0.5% (w/v) BSA): Add 0.88 g NaCl (MW 58.4) and 0.5% (w/v) BSA to 80 mL 0.01 M sodium phosphate pH 7.4. Mix thoroughly and adjust volume to 100 mL with 0.01 M sodium-phosphate pH 7.4.
Buffer E (PBS pH 7.4 with 0.1% (w/v) BSA): Add 0.88 g NaCl (MW 58.4) and 0.1% (w/v) BSA to 80 mL 0.01 M sodium phosphate pH 7.4. Mix thoroughly and adjust volume to 100 mL with 0.01 M sodium-phosphate pH 7.4.
B. 偶聯方案
B-1、清洗磁珠
1）將PuriMagTM磁珠重懸在樣品瓶中（即渦旋> 30 s，或傾斜并旋轉5分鐘）。
2）將所需體積的磁珠轉移到離心管中。
3）加入相同體積的緩沖液A或B，或至少加入1 mL，然后重懸。
4）將離心管放在磁力架上，棄去上清液。
5）從磁力架上移開試管，然后將洗滌后的磁珠重新懸浮在與磁珠初始體積相同的緩沖液A或B中（步驟2）。
B-2、將配體與PuriMagTM磁珠偶聯
該方案基于2.5 mg（?250μL）磁珠。對于大于10 mg磁珠的體積，請相應地按比例放大所有體積。
使用50μg配體/ mg磁珠。
最佳偶聯濃度為?2.5 mg磁珠/ mL，以實現有效混合。
1) 將250μL洗滌并重懸的珠子轉移至新離心管中，置于磁力架上以除去上清液。
2) 將磁珠重懸于100μg配體中，并添加緩沖液A（或B），使總體積為150μL。通過渦旋或移液徹底混合。
3) 加入100μL緩沖液C，通過移液混合。
4) 在37°C的旋轉孵育12~18小時。
5) 將離心管放在磁力架上以除去上清液。
6) 從磁力架上移開離心管，加入1 mL緩沖液D，在37°C混懸孵育1小時。
7) 將離心管放在磁力架上以除去上清液。
8) 從磁力架上移離心管，并加入1 mL Buffer E，渦旋5~10秒。
9) 將離心管放在磁力架上以除去上清液。
10) 重復步驟7–8。
11) 重懸并稀釋緩沖液E中的磁珠，以達到最終所需的磁珠濃度。
B-3、分離靶蛋白
1 mg偶聯的磁珠通常結合1~ 20μg靶蛋白，但因應用而異。因此，需要優化。如果目標蛋白的濃度非常低，通常需要增加配體偶聯珠的數量。該方案基于如上所述的1 mg配體偶聯磁珠。
1) 將1~20 ug含目標蛋白的樣品添加到100 uL的配體偶聯磁珠中。
2) 傾斜孵育以捕獲目標蛋白質。
3) 將離心管放在磁力架上2分鐘（粘性樣品需要更長的時間）。移去上清液。
4) 從磁力架移開試管，并加入1 mL 的Buffer D或E，渦旋振蕩5-10秒。
6) 重復步驟4–5兩次。
部分采用本磁珠文獻：
1. 李亞男, 季伙燕, 王天一, 沈蕾, 施秀英, 王建新. 血清肌鈣蛋白 I 液相色譜串聯質譜法建立及優化，化學學報，2019, 77, 539—544 （PuriMag G-Ts 磁珠偶聯抗體制備免疫磁珠對血清cTnI 進行富集.）
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