SP3（single-pot, solid-phase-enhanced sample-preparation）是一種基于順磁顆粒的蛋白質(zhì)組預處理工作流程，通過有機溶劑乙醇或乙腈驅(qū)動驅(qū)動蛋白在羧基或其它親水性磁珠表面被捕獲（如圖所示）。標準 SP3流程中，蛋白質(zhì)通過親水相互作用機制與磁珠結(jié)合，結(jié)合了蛋白的磁珠被束縛在溶劑化層，可沖洗去除不需要的污染物，然后在一定條件下洗脫純化的蛋白質(zhì)。這種親水捕獲機制類似于親水相互作用色譜（HILIC）中所涉及的機制，已被廣泛證明是分離多種生物分子的有效工具。利用該機制，SP3可實現(xiàn)蛋白質(zhì)和肽的無偏回收、與大量化學物質(zhì)（如洗滌劑、離液劑和鹽）兼容，可在大范圍的輸入量上定量回收，促進自下而上的深層蛋白質(zhì)組學分析。SP3磁珠是Purimag Bead專為Protein Clean蛋白組學前處理設計的高效磁珠。其獨特的表面化學性質(zhì)和穩(wěn)定的磁性性能，使得SP3磁珠在蛋白分離、純化等過程中表現(xiàn)出色。無論是小規(guī)模實驗還是大規(guī)模生產(chǎn)，SP3磁珠都能提供高效、穩(wěn)定的蛋白組學前處理解決方案。
SP3是一種簡單的方案，其中所有步驟都在單管中進行，可快速完成，測試成本低。此外，其適用于機器人自動化，而無需定制硬件。由于這些優(yōu)勢，SP3已被用于大量蛋白質(zhì)組學實驗，從對單個人類卵細胞、果蠅胚胎、免疫細胞、腎和臨床腫瘤組織的高靈敏度篩選，到對細胞系、其它模式生物、純化提取物、染色質(zhì)中的蛋白質(zhì)-DNA相互作用以及細胞外基質(zhì)混合物的深入分析，都受益于SP3方案提供的簡單穩(wěn)健處理。SP3方案可與許多常用的磁珠類型和表面化學相容，如AMPure（Beckman-Colter）和其它羧基或胺基的磁珠（Dynabeads carboxyl、Dynabeads amine、MagReSyn carboxyl、MagReSyn amine和MagReSyn-HILIC）。理論上，任何有親水涂層的功能化磁珠都應與SP3兼容。SP3方案中最常使用的是Cytiva的Sera Mag SpeedBeads（GE Healthcare），提供了測定性能與成本之間最佳平衡。Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified [E7] Magnetic Particles (cat. no. 45152105050250，Hydrophilic)和Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified [E3] Magnetic Particles (cat. no. 65152105050250，Hydrophobic) 兩種類型的SeraMag磁珠的專有涂層在表面親水性方面差異微小。當在SP3中單獨使用時，這兩種磁珠類型提供了大致相同的性能，但可以觀察到基于親水性的肽富集效率的微小差異。使用兩種類型磁珠的組合來消除任何潛在的差異，能更好保持結(jié)果的一致。
廈門普睿邁格生物科技有限公司推出類似SeraMag兩種類型的磁珠SP3-H-Carboxyl和SP3-O-Carboxyl，可替代SeraMag磁珠在SP3方案中的應用。
SP3-H-Carboxyl
Cat：SP30045
1ml、15ml
Hydrophilic
SP3-O-Carboxyl
Cat：SP30065
Hydrophobic
l 概述
SP3-Carboxyl羧基磁珠是0.4 μm 磁性顆粒，表面有均勻羧基。具有快速的磁響應、高結(jié)合載量、大比表面積、高靈敏度，穩(wěn)定性好，物理完整性好，反應動力學快。SP3-Carboxyl羧基磁珠磁含量為（~ 70%）。
l 典型應用
蛋白組學樣品預處理SP3過程應用。
l 處理介紹
使用過程中，應控制顆粒的單分散性和均勻懸浮液，以提供穩(wěn)健且可重復的性能。將 SP3-Carboxyl羧基磁珠儲存在 2~ 8°C 下，如顆粒沉降，則重新懸浮。SP3-Carboxyl羧基磁珠在分子生物學中常用的較寬pH和溫度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，例如胍裂解緩沖液和 PCR 熱循環(huán)溫度。
l 重懸
顆粒不完全重懸會導致檢測開發(fā)問題。超聲重懸顆粒逆轉(zhuǎn)由偶聯(lián)反應誘導的輕度聚集。
l 滅菌
SP3-Carboxyl羧基磁珠不是無菌的。該制劑含疊氮化鈉（0.05%），如防止微生物生長的防腐劑。建議在顆粒長期儲存后評估細菌污染。細菌污染可以通過在適當?shù)纳L培養(yǎng)基上接種和在72小時后檢查平板來評估。珠子可以通過用70%乙醇洗滌來滅菌。不要將珠子高壓滅菌，因為這可能導致部分至嚴重的磁珠聚集。蛋白偶聯(lián)的微珠不能滅菌。
l 化學相容性
SP3-Carboxyl羧酸鹽修飾磁珠是與尿素（6 至 8 M）和 EDTA 相容。
l 防止聚合
為防止顆粒聚集，請避免以下情況：強酸性 pH 值（羧基和磺酸鹽基團質(zhì)子化）的緩沖液、強堿性pH值（胺基去質(zhì)子化）的緩沖液、冰凍溫度、加熱、過度渦流、過度超聲處理（特別是對于蛋白質(zhì)標記的磁珠）、微生物。
蛋白質(zhì)制備 ● 定時 2 小時
1 將 ThermoMixer 預熱至 60 °C。
2 在 1.5 mL 試管中以 1 mg/mL 的復溶溶液制備 1 mL BSA 儲備溶液。
關(guān)鍵步驟 如果使用需要還原和烷基化但尚未進行還原和烷基化的蛋白質(zhì)混合物（例如細胞裂解物），請在此處用您的樣品代替 BSA 輸入并按照說明進行操作。
3 將準備好的BSA原液管在60°C的ThermoMixer中加熱30分鐘，以1000 r.p.m混合。
4 從熱混合器中取出試管，使其在實驗室工作臺的架子中冷卻至室溫。
5 向BSA管中加入100μL的 IAA儲備液來烷基化還原二硫化物，然后室溫避光孵育30分鐘。
關(guān)鍵步驟 IAA 對光敏感。溶液應新鮮制備，并在黑暗中進行孵育。
6 向BSA管中加50μL的DTT原液淬滅烷基化反應，然后室溫孵育15分鐘。
暫停點 制備的樣品（本例中為BSA）可以無限期地儲存在-80°C下。
SP3 蛋白純化和消化 ● 定時 30 分鐘 + 18 小時孵育
7 將 ThermoMixer 預冷至 24 °C。
8 在復溶溶液中將制備的10 μg（10 μL 制備的1 mg/mL 原液）BSA稀釋至最終體積48 μL。
9 加入100 μg的SP3磁珠并移液混勻。這是2 μL（50μg/μL SP3）磁珠原液，終體積為 50 μL 蛋白質(zhì)溶液。
關(guān)鍵步驟 確保溶液中SP3磁珠完全均質(zhì)化。輕柔移液吹打混合。混合不當會降低SP3的蛋白質(zhì)回收效率。
10 為誘導蛋白質(zhì)與珠子結(jié)合，向含SP3珠子的BSA混合物中加入50 μL乙醇。短暫搖晃試管以均質(zhì)化。
關(guān)鍵步驟 避免加入乙醇后過度搖晃混合物，盡量減少磁珠粘附在管上部而造成的損失。通過初始混合步驟完全均質(zhì)化并非必需；水相和乙醇相部分整合就足夠了。在下一步孵育中，將使用混勻儀完全混合。
11 將結(jié)合混合物在24°C的ThermoMixer中以1,000 r.p.m孵育5分鐘。
關(guān)鍵步驟 避免以>1000 r.p.m.的速度混合。快速混合會導致聚集的磁珠粘附管壁，可能降低蛋白回收率。
關(guān)鍵步驟 觀察孵育后磁珠的聚集。微珠的聚集表明蛋白質(zhì)在微珠表面結(jié)合。聚集量與輸入材料的數(shù)量成正比，并取決于結(jié)合條件（例如，反應體積和珠子數(shù)量）。
12 結(jié)合完成后，將試管放入磁力架中并孵育，直到珠子遷移到管壁上。
關(guān)鍵步驟 觀察被磁架吸引時管壁上珠子的結(jié)合模式。珠子在內(nèi)管壁周圍分布是結(jié)合材料的良好指示。非常細的珠子線可能表明少量或沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)。
13 取出未結(jié)合的上清液并將其丟棄在適當?shù)膹U液容器中。
關(guān)鍵步驟 從試管中取出上清液，注意不要破壞磁珠。
關(guān)鍵步驟 在故障排除過程中，可以保留上清液并通過另一種測定法（例如，SDS-PAGE）進行分析，以檢查SP3結(jié)合步驟的效率。在該上清液中應觀察到很少或沒有蛋白質(zhì)。
14 從磁架上取下試管，加入180 μL的80%乙醇SP3沖洗液和移液器混合以復溶并沖洗珠子。
關(guān)鍵步驟 在移液器混合和沖洗SP3珠子時，沒必要過于激烈。強力混合會導致蛋白質(zhì)損失。建議使用200 μL吸頭進行標準移液，在用180 μL體積的80%乙醇復溶磁珠后進行3~4次。
15 將試管放在磁架上并孵育，直到珠子遷移到管壁上。
16 取出上清液，注意不要破壞珠子。
關(guān)鍵步驟 上清液可以保留并通過另一種測定進行分析（例如，SDS-PAGE）作為故障排除過程的一部分，以確定漂洗步驟中的潛在損失。在該上清液中應觀察到很少或沒有蛋白質(zhì)。
17 再重復步驟 12-16 兩次，以完全沖洗與 SP3 珠子結(jié)合的蛋白質(zhì)。
關(guān)鍵步驟 去除最后的 80% 乙醇沖洗液后，注意從試管中取出盡可能多的殘留沖洗液（<5 μL 是最佳的），以避免殘留到酶消化步驟中。無需將 SP3 磁珠完全風干。
18 從磁架上取下試管，加入 100 μL 含有 0.4 μg 胰蛋白酶 + rLysC 混合物的消化溶液。
關(guān)鍵步驟 加入消化液后，不要用移液管混合磁珠。避免粘稠SP3磁珠附著在移液吸頭上，從而導致?lián)p失。
關(guān)鍵步驟 此處胰蛋白酶用量僅用于示例。常使用1：25（wt/wt）的胰蛋白酶與蛋白比例進行標準消化。該比率應根據(jù)樣品類型進行優(yōu)化。
19 使用200 μL移液器，輕輕地將未被液體覆蓋的珠子沿管壁推入消化溶液中。不要嘗試移液混合物。
關(guān)鍵步驟 如SP3磁珠加入消解液后自然復溶成溶液，則輕搖試管將所有磁珠移入液體中。不要輕彈管子。
20 如可用，在水浴中超聲處理30秒以分散。如無超聲水浴，則37°C和1000 r.p.m.混合孵育10分鐘。
關(guān)鍵步驟 超聲處理增強了消化前珠子的解聚。在超聲儀中孵育，直到觀察到珠子的分解。
關(guān)鍵步驟 這種預孵育可幫助分散磁珠，更易移液。然而，孵育后磁珠可能仍非常粘稠，尤其在蛋白質(zhì)量很高的情況下。可延長孵育時間，以允許蛋白開始水解（如，1-2 小時），以進一步增強磁珠的重建。
21移液混合以確保珠子正確復溶，并在37°C下ThermoMixer中以1000 r.p.m.混合孵育18小時。
關(guān)鍵步驟 此處使用的消化孵育時間僅用于示例。較短的持續(xù)時間可成功使用，但應根據(jù)樣品類型優(yōu)化。
22消化完成后，將試管在20,000g下在24°C離心1分鐘。
關(guān)鍵步驟 執(zhí)行離心步驟將有助于肽回收，而不會殘留微球，因為SP3微球會堵塞色譜柱。
23 將試管放在磁架上，直到珠子沉淀在試管壁上，然后將上清液移到新試管中。
關(guān)鍵步驟 收集上清時避免去除磁珠而干擾下游分析。重復離心（步驟22），如磁珠殘留，則回收上清。
關(guān)鍵步驟 如果樣品含有珠子，請勿繼續(xù)冷凍儲存。確保在儲存前完全去除珠子。
暫停點 制備的肽可以無限期地儲存在-80°C下。
24 繼續(xù)對肽樣品進行MS分析。
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